《The Plant Genome》：Highly heterozygous Citrus changshan-huyou Y. B. Chang originated from ancient hybridization between mandarin and pummelo and displayed distinct tissue-specific allelic imbalance
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为明确特色柑橘地方品种“常山胡柚”（Citrus changshan-huyou）的演化起源，研究人员对一棵120年树龄的“祖先树”进行了PacBio长读长结合Hi-C测序，组装了HY1和HY2两个高质量的单倍型解析基因组。研究首次明确其起源于宽皮橘和柚的古老杂交，并发现其基因组杂合度高达3.07%，为已发表柑橘基因组中最高。通过多组织转录组分析，揭示了在根部等组织中存在的显著等位基因表达失衡（AI）模式，为研究远缘杂交后的基因组进化提供了有趣模型。
柑橘，作为全球产量第三大的水果，以其丰富的风味、营养价值和复杂的网状进化历史，一直是植物基因组学和进化生物学研究的绝佳材料。在众多的柑橘品种中，有一个特别的存在——常山胡柚（Citrus changshan-huyou Y. B. Chang, Huyou）。这个起源于中国浙江常山县的特色地方品种，以其果皮金黄、风味独特、富含多种有益健康的营养成分而闻名，然而，其“身世”却一直笼罩在迷雾之中。它从何而来？是哪种柑橘的自然杂交后代？这个谜题长期困扰着当地植物学家和种植者。尽管有一些研究试图通过传统分子标记来追溯其起源，但由于数据限制，仅获得了有限的遗传学见解。近年来，随着测序技术的发展，多种重要柑橘物种的参考基因组得以公布，揭示了现代柑橘品种多是宽皮橘、柚和枸橼等少数祖先种杂交的结果，但关于常山胡柚这一独特地方品种的基因组起源、驯化和演化分析仍有待深入阐明。为了解开常山胡柚的起源之谜，并深入探索其作为自然杂交柑橘的独特基因组特征，一项发表在《The Plant Genome》杂志上的研究，对一棵被当地人视为“祖先树”的120年树龄常山胡柚古树进行了深入的基因组“解码”。
为了回答这些问题，研究人员综合利用了多种现代组学技术。他们从这棵位于浙江常山的“祖先树”上采集了新鲜叶片、嫩枝和果实样本，用于DNA和RNA的提取。首先，通过Illumina短读长测序进行了基因组调查，估算了基因组大小和杂合度。为了获得高质量的基因组组装，研究采用了PacBio HiFi长读长测序和Hi-C染色体构象捕获测序技术，并利用hifiasm软件进行了单倍型解析的从头组装，最终获得了HY1和HY2两个单倍型基因组。通过Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO)评估了组装的完整性。利用GeMoMa软件基于同源性和转录组证据进行了基因模型预测，并对重复序列、非编码RNA等进行了注释。为了追溯祖先起源，研究采用了基于k-mer的追踪方法，将HY1和HY2的基因组与宽皮橘、柚和枸橼的参考基因组进行比对。此外，还利用OrthoFinder和MCMCTree进行了系统发育和分化时间分析，并利用CAFE分析了基因家族的扩张与收缩。研究还下载了已发表的六个组织（根、茎、叶、花、未成熟果实、成熟果实）的转录组数据，通过STAR和RSEM进行比对和定量，分析了HY1和HY2之间同线基因的表达水平，以探究等位基因失衡现象。结构变异分析则通过SyRI软件完成。
3.1 120年树龄“常山胡柚”祖先树的基因组组装与注释
通过对这棵120年树龄、至今仍枝繁叶茂的“祖先树”进行测序，研究成功组装了两个单倍型解析的染色体级别基因组HY1和HY2。核型分析证实其染色体数为2n=2x=18。K-mer分析显示其基因组杂合度高达3.07%，显著高于已报道的其他杂交柑橘（1.5%–2.4%）。HY1和HY2基因组大小分别为326.65 Mb和322.79 Mb， contig N50分别达到21.15 Mb和18.77 Mb，超过91%的序列被锚定到9条染色体上，BUSCO完整性评估均超过97.7%，表明组装质量很高。基因组注释显示，两个单倍型分别预测出约42,000个蛋白质编码基因，且重复序列（主要是LTR反转录转座子）占比均超过55%。
3.2 胡柚单倍型基因组HY1和HY2的祖先追溯
利用k-mer追踪方法，研究精确解析了HY1和HY2的祖先组成。结果显示，HY1基因组的87.8%来源于宽皮橘，7.3%来源于柚；而HY2基因组的85.0%来源于柚，2.9%来源于宽皮橘。这强有力地表明常山胡柚起源于宽皮橘和柚的一次杂交事件。进一步分析发现，HY1的第8号和第9号染色体上存在来自柚基因组的明显片段渗入，表明杂交后发生了染色体重组。长末端重复反转录转座子（LTR-RT）的插入时间分析也显示HY1和HY2具有不同的分布模式，支持它们来自两个不同的祖先。
3.3 HY1和HY2的系统发育定年与基因家族分析
基于单拷贝基因的系统发育分析表明，HY1与宽皮橘类群聚在一起，而HY2与柚类群聚在一起。分化时间估算显示，HY1和HY2分别在约200万年前和218万年前发生分化，早于一些已知的柑橘物种间的分化事件。基因家族分析显示，HY1分支发生了显著的基因家族扩张（+345），而HY2分支的扩张（+255）和收缩（-162）相对平衡。研究还发现，与柑橘果实品质相关的重要代谢通路（如类萜、类胡萝卜素、苯丙烷、黄酮类化合物生物合成等）的基因成员在包括HY1和HY2在内的柑橘物种中普遍存在扩张现象。
3.4 HY1和HY2的同线性与结构变异分析
基因组比对揭示了HY1和HY2之间以及它们与其祖先基因组（宽皮橘和柚）之间存在广泛的同线性，但也鉴定出大量的结构变异。HY1与其祖先宽皮橘之间结构变异较少，而与HY2之间则存在较多大型倒位、易位和复制事件，特别是在第8、9号染色体上。遗传变异（单核苷酸多态性[SNP]和插入缺失[indel]）分析显示，这些变异在染色体末端区域更为密集。值得注意的是，许多与果实品质相关的代谢通路基因位于这些高变异区域，暗示了常山胡柚在重要农艺性状上可能存在较高的等位基因多样性。
3.5 不同胡柚组织中基因表达谱的等位基因失衡
作为目前已知杂合度最高的柑橘基因组，常山胡柚为研究杂交后的基因组进化提供了绝佳模型。通过对六个组织的转录组数据分析，研究比较了HY1和HY2之间同线基因的表达水平，发现了普遍的等位基因失衡现象。总体而言，HY2等位基因的表达在大多数组织和染色体上略占优势。尤为突出的是，在根组织中，HY2的等位基因优势非常显著（HY2优势基因占12.5%，HY1优势基因占7.24%），表现出强烈的组织特异性模式。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析显示，在根和成熟果实组织中，受等位基因失衡影响的基因显著富集于与抗氧化剂生物合成（如类黄酮、苯丙烷、类胡萝卜素）以及脂质代谢相关的通路。
3.6 关键通路中的组织特异性等位基因失衡
以控制果实色泽和风味的类胡萝卜素生物合成通路为例，研究绘制了HY1与HY2同线基因表达比值的通路图。结果显示，虽然通路的主要组成部分没有表现出明显的等位基因偏好，但负责虾青素生物合成的一些关键基因（如β-胡萝卜素3-羟化酶、紫黄质脱环氧化酶）在不同的组织中表现出清晰的组织特异性等位基因表达模式。此外，拷贝数变异（copy number variation, CNV）分析表明，常山胡柚在类胡萝卜素通路的大部分基因上存在拷贝数变化，且其中超过一半的京都百科全书同源基因在常山胡柚中具有最高的拷贝数。表达分析进一步揭示了这些基因在花和根组织中表达最高，部分基因在果实发育中可能具有关键作用。
本研究通过构建常山胡柚高质量的单倍型解析基因组，首次明确并量化了其起源于宽皮橘和柚的古老杂交事件，解决了长期困扰学界的起源之谜。研究突出强调了常山胡柚高达3.07%的基因组杂合度，在已发表的柑橘基因组中名列前茅，这使其成为一个研究基因组进化，特别是高杂合性杂交物种演化的极具价值的模型。单倍型解析的基因组数据使得精确追溯祖先成分、鉴定染色体重组（如HY1的8、9号染色体）和结构变异成为可能，提供了前所未有的基因组细节。系统发育分析表明HY1和HY2代表了两个先前未报道的新祖先基因组谱系，丰富了柑橘的遗传资源库。转录组分析进一步揭示了广泛存在的等位基因表达失衡现象，尤其是在根组织中HY2等位基因显著占优，表现出明显的组织特异性。KEGG富集分析表明，受等位基因失衡影响的基因主要与抗氧化剂生物合成和脂质代谢相关，这可能与杂交后的环境适应有关。在类胡萝卜素等关键果实品质通路中观察到的组织特异性等位基因表达模式和基因拷贝数变异，为解释常山胡柚独特的风味和品质提供了遗传学线索。
总之，这项研究不仅终结了关于常山胡柚起源的争论，更重要的是，它展示了单倍型解析基因组在解析柑橘复杂网状进化历史中的强大能力。研究所获得的高质量基因组资源、明确的祖先成分图谱以及发现的丰富遗传变异和等位基因表达模式，为未来挖掘常山胡柚的优异等位基因、指导柑橘育种以及深入研究远缘杂交后的基因组进化机制奠定了坚实的基础。
