《Toxins》：De Novo Assembly and Characterization of Venom Gland Transcriptome for Rhabdophis lateralis
Jiahao Chen,
Qin Liu,
Songwen Tan,
Peng Guo and
Lianming Du
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为解决传统认为无毒但临床报道有致命风险的赤链蛇(Rhabdophis lateralis)毒液成分不明的问题，研究人员对其杜氏腺(Duvernoy’s gland)进行了转录组从头组装与分析。研究鉴定出SVMP、CRISP、CTL和3FTx等26个毒素家族的转录本，揭示了其以P-III类SVMP和CTL等凝血毒素为主的表达谱，为阐明其临床凝血障碍症状的分子机制、理解后沟牙蛇类毒素进化提供了关键数据。
长久以来，赤链蛇（Rhabdophis lateralis）一直被广泛认为是一种无毒蛇。然而，来自中国广西、福建乃至日本的临床记录却描绘了另一幅图景：其咬伤可能导致严重的凝血功能障碍，甚至引发弥散性血管内凝血（DIC）并造成死亡。这种巨大的认知鸿沟凸显了对该物种毒液成分了解的根本性匮乏。作为后沟牙蛇，赤链蛇的毒液产生器官是杜氏腺（Duvernoy’s gland），而非传统毒蛇的毒腺，其毒液传递效率相对低下，且物种曾被划为虎斑颈槽蛇（R. tigrinus）的亚种，这都导致了对其毒性的长期忽视。厘清其毒液的分子构成，不仅是解决临床中毒救治难题的关键，也是理解后沟牙蛇类（Colubridae）毒液进化的重要窗口。为此，研究团队在《Toxins》发表了论文，首次对赤链蛇杜氏腺的转录组进行了系统性的从头组装和深入解析，揭开了其毒液成分的神秘面纱。
为了探究赤链蛇毒液的分子基础，研究者从中国湖北咸宁和四川广元采集了三只成年赤链蛇个体，分别取其左右两侧的杜氏腺进行转录组测序。在数据分析环节，研究者综合运用了多种关键技术：首先，利用Fastp、Pear等工具对原始测序数据进行严格的质控和预处理，确保数据质量。接着，研究者并未依赖单一组装工具，而是创造性地采用了Trinity、extender、SPAdes-trans和SOAPdenovo-Trans四种不同的组装软件进行从头（de novo）组装，然后将组装结果合并，再通过CD-HIT进行冗余序列去除，旨在获得最完整、高质量的转录本集合。随后，利用ToxCodan这一专门用于毒素注释的生物信息学工具，结合分泌肽预测（SignalP）和多种公共数据库（如NR、GO、KEGG、InterProScan）的比对，对转录本进行功能和毒素家族鉴定。最后，通过Bowtie2和RSEM进行转录本定量分析，并利用MUSCLE进行多序列比对，结合RAxML构建最大似然系统发育树，以解析主要毒素家族的分子特征与进化关系。
2.1. 转录组组装与功能注释
对三个样本的测序数据进行分析，获得了高质量、高数量的纯净读长。组装并去冗余后，平均得到336,299个重叠群（contigs）。通过编码序列（CDS）预测，最终鉴定出6196个被注释的转录本。功能注释分析显示，生物过程（BP）是GO注释中最主要的类别，而KEGG通路分析中，“信号转导”和“全局与概览图”是基因最富集的通路。图示的韦恩图（Venn diagram）显示四个数据库共注释了15,430个序列。
2.2. 潜在毒素基因的鉴定
在6196个被注释的转录本中，鉴定出77个潜在毒素转录本，分属于26个毒素家族。其中，蛇毒金属蛋白酶（SVMP）家族表达量最高，占毒素总表达量的51.10%。其他主要毒素包括富含半胱氨酸分泌蛋白（CRISP， 22.36%）、C型凝集素（CTL和snaclec， 12.13%）和三指毒素（3FTx， 6.36%）。次要成分还包括Kunitz型抑制剂、磷脂酶B、waprin、蛇毒丝氨酸蛋白酶等。该结果以条形图、饼图和热图清晰地展示了不同毒素家族的相对丰度和在个体间的表达模式，证实了SVMP、CRISP、CTL和3FTx是赤链蛇毒液中的核心成分。
2.3. 主要毒素的序列与系统发育分析
研究发现的所有SVMP转录本变异体均被归类为P-III型。它们都包含保守的HEXXHXXGXXH金属蛋白酶催化基序。其中一个序列（SVMP13）在去整合素样（disintegrin-like）结构域中表现出独特的内部缺失，这与常规的截短模式不同。系统发育分析表明，赤链蛇的SVMP序列在游蛇科内形成了两个单系群，显示出在科内相对保守的进化模式。图5详细展示了SVMP的结构域组成和序列特征。系统发育树进一步支持了这一结论。
尽管只鉴定出一个CRISP转录本，但其表达水平极高。该序列与此前报道的Rhabdophis属物种的CRISP序列完全一致。系统发育分析显示，赤链蛇的CRISP与游蛇科的序列聚在一起，但R. subminiatus和R. tigrinus形成了一个独立的分支，表明该谱系在祖先分化后经历了独立进化。
研究共鉴定出12个CTL序列。其中，CTL1是表达最丰富的CTL转录本，它缺乏经典的功能基序（EPN或QPD），但具有α链的特征，可能参与形成蛇C型凝集素样蛋白（snaclec）二聚体，从而发挥强效的促凝血或抑制血小板聚集活性。与SVMP和CRISP不同，赤链蛇的CTL序列并未聚集在一个保守的谱系中，而是与来自多个科的序列混合在一个大的分支里，这可能反映了此类毒素在不同毒蛇中发生了趋同进化。
在赤链蛇中鉴定出的3FTx具有保守的信号肽序列和典型的8个半胱氨酸残基排列。转录组分析显示，3FTx约占毒素总表达量的6.36%，并非最主要的毒素成分。系统发育分析表明，赤链蛇的3FTx序列与同属的红脖颈槽蛇（R. subminiatus）关系密切，共同形成了一个具有长分支长度的独立谱系。
本研究通过赤链蛇杜氏腺的转录组分析，首次全面揭示了其复杂的毒素转录本组成。其毒液表达谱以凝血相关毒素为主导，尤其是P-III型蛇毒金属蛋白酶（SVMP）和C型凝集素（CTL），而富含半胱氨酸分泌蛋白（CRISP）和三指毒素（3FTx）等神经毒性成分则作为次要组分存在。这一发现为该物种咬伤后出现严重凝血病的临床观察提供了直接的分子解释。尽管历史上该物种被视为无毒，但SVMP和CTL的高表达强烈提示其毒液能通过破坏凝血系统造成严重后果。在Rhabdophis属中，严重中毒仅报道于赤链蛇和红脖颈槽蛇，这表明了其独特的进化轨迹。系统发育分析显示，SVMP、CRISP和3FTx在游蛇科内进化上相对保守，而CTL则更可能通过趋同进化产生。尽管这些主要毒素与近缘物种聚类，但它们仍表现出显著的分化（反映为长分支长度）。总之，这项研究不仅扩展了Rhabdophis属的毒素数据库，为理解后沟牙蛇毒液的进化、以及未来研究其临床中毒机制和潜在的药理价值提供了重要的分子基础和数据支持。
