《Diagnostics》：Clinical Utility of Small Extracellular Vesicles as Liquid Biopsy for Oral Mucosal Disease Diagnostics: Emerging Perspectives
Olawande Funmilola Adebayo,
Dada Oluwaseyi Temilola,
Foluso John Owotade and
Manogari Chetty
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本综述系统探讨了小细胞外囊泡（sEVs）作为非侵入性液体活检在口腔黏膜疾病（如手足口病、口腔扁平苔藓、口腔白斑、口腔鳞状细胞癌）早期诊断中的应用前景。文章详述了sEVs（亦称外泌体）的生物发生、组成、功能及其作为诊断生物标志物（如miRNA、蛋白质）的潜力。文中表格与示意图（例如）直观展示了sEVs的来源与应用，强调了其克服传统组织活检局限性的潜力，并指出了迈向临床转化所面临的挑战。
引言：口腔黏膜与诊断新需求
口腔黏膜是覆盖口腔内部的复层鳞状上皮，行使保护、感觉、分泌等重要功能。然而，多种疾病可累及口腔黏膜，其中一些（如口腔鳞状细胞癌）可危及生命。传统诊断金标准——组织活检存在侵入性、有创、可能因病灶异质性导致取样不准确等问题，且常因患者就诊晚而延误诊断。因此，开发一种高灵敏度、高特异性、非侵入且便捷的早期诊断方法势在必行。液体活检，特别是基于小细胞外囊泡的检测，为此带来了新希望。
小细胞外囊泡：从“细胞垃圾袋”到“信息使者”
小细胞外囊泡是直径约30-150纳米的脂质双层囊泡，曾被认为是细胞排出废物的“垃圾袋”，现被证实是细胞间通讯的关键“信使”。它们几乎存在于所有体液中，如血液、唾液，其内部承载的蛋白质、脂质、核酸（如DNA、miRNA、circRNA、lncRNA）精确反映了来源细胞的生理与病理状态，这使其成为极具潜力的疾病生物标志物来源。
sEVs通过内体途径生成：早期内体形成后，向内出芽形成多囊体，富含胆固醇的多囊体与细胞质膜融合，最终将sEVs释放到细胞外。其生物发生机制可分为依赖ESCRT（内体分选复合体）和不依赖ESCRT（如神经酰胺、四跨膜蛋白途径）两大类。
它们的组成复杂而特异。脂质（如神经酰胺、胆固醇）对维持结构至关重要；蛋白质则分为通用蛋白（如膜融合相关的热休克蛋白HSPs、ESCRT相关蛋白ALIX、TSG101）和特异性蛋白（取决于来源细胞类型和状态）。核酸成分中，微小RNA（miRNA）最为丰富，参与调控细胞发育、血管生成甚至癌变等过程。sEVs的功能广泛，涉及细胞信号传递、免疫调节、干细胞发育分化，并在肿瘤进展、转移和病原体传播中扮演角色。示意图总结了sEVs的来源及其在多组学领域的下游应用。
sEVs的分离与鉴定：通往应用的必经之路
从体液中高效、高纯度地分离sEVs是研究与应用的前提。现有方法各具特点：基于物理性质的超速离心、尺寸排阻色谱法能获得高纯度sEVs但过程复杂、设备昂贵；基于生化特性的免疫亲和捕获法特异性高，成本也高；而沉淀法（如ExoquickTM试剂盒）虽操作简单、产量高，但纯度相对较低。微流控技术则整合了物理与生化原理，是新兴方向。
分离后，需对sEVs进行表征。定量表征最常用，包括使用纳米颗粒追踪分析进行计数、透射电镜观察形态、动态光散射分析粒径、蛋白质印迹或ELISA检测特定蛋白标志物（如CD63、CD81）、以及通过qPCR或测序分析核酸含量。
sEVs作为口腔黏膜疾病的诊断生物标志物
手足口病（HFMD）
HFMD是由肠道病毒引起的急性传染病，主要影响儿童。一项研究发现，与健康儿童相比，HFMD患儿血清sEVs中的miR-16-5p表达上调（轻症和重症分别上调5.98倍和10.31倍），而miR-150-3p和miR-671-5p表达下调。这些差异表达的miRNA有望成为HFMD的诊断标志物，但需更多研究，尤其是在唾液sEVs中进行验证。
口腔扁平苔藓（OLP）
OLP是一种慢性免疫炎症性疾病，被世界卫生组织列为口腔潜在恶性疾患，有约1-2%的恶变风险。研究发现，OLP患者唾液sEVs中多种miRNA表达异常：miR-4484、miR-21、miR-125b、miR-203、miR-15b表达上调，而miR-125a、miR-27b、miR-146a、miR-155表达下调。此外，血浆sEVs中miR-34a-5p和miR-130b-5p上调，miR-301b-3p下调。T淋巴细胞来源的sEVs还能诱导炎症趋化因子（如MIP-1α/β、IL-10、IL-17）上调，这些分子都可能成为OLP的诊断标志物。
口腔白斑（OL）
OL是最常见的口腔潜在恶性疾患，传统诊断依赖活检。研究显示，OL患者唾液sEVs中可溶性CD44和总蛋白水平升高，且与临床严重程度正相关。这提示sEVs cargo有潜力用于OL的早期发现与监测。
口腔鳞状细胞癌（OSCC）
OSCC是最常见的口腔癌，早期诊断对改善预后至关重要。sEVs展现出巨大诊断潜力。研究发现，与健康人相比，OSCC患者唾液sEVs的尺寸、数量、浓度和聚集性均增加，且蛋白质 cargo 发生改变，如CD63表达升高，CD81、CD9表达降低。唾液sEVs中多种miRNA表达异常，例如miR-412-3p、miR-512-3p、miR-24-3p、miR-31、miR-486-5p等上调，而miR-10b-5p下调。更有一些miRNA（如miR-302b-3p、miR-517b-3p）仅在OSCC患者唾液sEVs中特异性表达。在血液sEVs中，层粘连蛋白332、载脂蛋白A1（APOA1）等蛋白以及miR-210、miR-130a等miRNA也被发现与OSCC或其淋巴结转移相关。
挑战、局限与未来方向
尽管前景广阔，sEVs诊断迈向临床仍面临诸多挑战。个体生物差异、不同分离与鉴定方法带来的技术变异、缺乏大规模临床验证以及标准操作流程的缺失，都影响了sEV生物标志物的可靠性与可重复性。液体活检技术的高成本以及对专业设备和人员的需求，也在中低收入国家构成实施障碍。
未来研究需致力于开发在资源有限环境中可行、可负担且可扩展的液体活检方案。基于人群的研究对于验证人群特异性生物标志物至关重要。持续的技术创新旨在降低成本、减少技术变异、简化操作。在政策层面，增加对卫生基础设施、实验室能力和人员培训的投入，对于将sEVs诊断整合进常规临床护理至关重要。
结论
唾液和血液来源的sEVs在口腔黏膜疾病诊断中展现出巨大潜力。大量证据表明，sEV cargo（特别是miRNA和特定蛋白质）在手足口病、口腔扁平苔藓、口腔白斑和口腔鳞状细胞癌等疾病中会发生特异性改变。这些分子特征不仅为早期检测，也为监测疾病进展和治疗反应提供了希望。通过持续的科研、技术和政策进步，基于细胞外囊泡的诊断有望成为精准口腔医学的核心组成部分。
