《Veterinary Sciences》：Diagnosis and Surveillance of West Nile Virus Infection in Horses: Current Methods, Challenges, and Future Directions
Paula Nistor,
Livia Stanga,
Vlad Iorgoni,
Alexandru Gligor,
Alexandru Ciresan,
Horia Iorgoni,
Bogdan Florea,
Vlad Cocioba,
Ionica Iancu and
Viorel Herman
+ 2 authors
编辑推荐：
这篇综述系统性地梳理了西尼罗河病毒（WNV）在马匹中的诊断与监测策略。由于马匹病毒血症持续时间短、水平低，使得RT-qPCR等直接检测方法敏感性受限，诊断主要依赖血清学方法（如IgM/IgG ELISA），但存在与相关黄病毒交叉反应及疫苗干扰的挑战。文章还讨论了被动临床监测、主动血清学监测和哨兵马群监测等策略的优缺点，并强调需整合动物、媒介和环境数据，以提升One Health框架下的早期预警和疫情防范能力。
西尼罗河病毒（WNV）概述与流行病学背景
西尼罗河病毒（West Nile virus, WNV）是一种蚊媒黄病毒，对欧洲乃至全球的人类和马匹健康构成日益增长的威胁。该病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）、正黄病毒属（Orthoflavivirus），其传播主要依赖一个地方性流行循环：鸟类（尤其是迁徙和留居的雀形目鸟类）作为主要扩增宿主，库蚊（Culex spp.）作为主要媒介。马匹和人类作为偶然（或称“终末”）宿主，感染后通常病毒血症水平低且短暂，不足以支持病毒进一步传播，但他们共享相似的生态暴露环境。
近年来，WNV在欧洲的流行病学发生了显著变化。谱系2（Lineage 2）已在中欧和东欧广泛确立，而气候变化、鸟类迁徙模式、媒介适应和环境改变等因素共同导致了疫情暴发频率、强度和地理范围的增加。欧洲多个地区已报告了广泛的人马感染病例。此外，相关黄病毒（如Usutu病毒）的共同流行，进一步增加了临床和血清学诊断的复杂性。
马匹的临床意义与哨兵价值
虽然大多数马匹感染WNV后呈亚临床症状，但出现临床症状的马匹可能发展为严重的神经系统疾病，包括共济失调、脑神经功能缺陷、轻瘫、卧地不起等，某些疫情中的病死率可达23–43%。由于马匹与人类生活环境重叠且高度暴露于蚊媒，马匹的感染通常与或先于人类病例发生。这一特性使其成为“One Health”（同一健康）监测框架下，用于探测本地病毒循环的宝贵哨兵物种。血清学调查显示，欧洲不同地区的马匹血清阳性率存在显著地理差异，在湿地和河流相关的生态系统中更高。
马匹WNV感染的诊断方法
对马匹WNV感染的诊断评估依赖于直接和间接方法的结合，但各有其特定的优势和局限性。
直接检测方法
分子检测方法，如实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR），是检测全血、血清、脑脊液或死后中枢神经系统组织中WNV RNA的首选方法。它能提供高特异性，并允许进行病毒谱系区分。然而，马匹的病毒血症短暂且水平低，通常在出现神经系统症状时已低于检测限。因此，RT-qPCR阴性结果并不能可靠地排除感染。病毒分离和免疫组织化学（IHC）虽是确诊工具，但由于需要生物安全三级（BSL-3）设施、耗时且通常仅适用于死后组织检查，在常规诊断中应用有限。
间接检测方法（血清学）
由于直接检测在临床病例中经常失败，血清学检测对于识别近期或既往WNV暴露至关重要。
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IgM捕获ELISA：检测血清或脑脊液中的WNV特异性IgM抗体是近期感染最可靠的指标。IgM抗体在感染后不久出现，通常持续数周。虽然该方法具有良好的特异性，但其敏感性会因抗体滴度低或采样延迟而受到影响。
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IgG ELISA与竞争/封闭ELISA：基于IgG的检测方法，包括竞争性或表位封闭ELISA，广泛用于马匹血清学调查和评估累积暴露。它们具有高通量、灵敏度高的优点，适合大规模筛查。然而，这些方法无法区分近期与既往感染，也不能区分自然感染与疫苗诱导的免疫，且存在与相关黄病毒（如Usutu病毒）的交叉反应。
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病毒中和试验：中和试验（VNT/PRNT）因其高特异性及解析血清学交叉反应的能力，仍然是确认WNV特异性抗体的金标准。但其操作劳动密集，需要操作活病毒，检测周期长，在常规诊断实验室中普及有限。
诊断结果解读与工作流程
准确解读诊断结果需要整合实验室发现、临床表现、流行病学背景和采样时机。阳性IgM ELISA或可检测到的病毒RNA有力地支持近期急性感染。相反，单独存在IgG，尤其是在临床健康的马匹中，通常反映的是历史暴露或疫苗接种。在已接种疫苗的群体中，由于许多检测方法无法区分免疫应答，血清学解读必须谨慎。
一个实用的诊断流程始于对有相容神经系统症状的马匹尽早采集血清，并在可行时采集脑脊液。在感染早期，建议同时进行RT-qPCR和IgM ELISA检测。阳性结果提示可能为急性WNV感染。当两项检测均为阴性但临床仍高度怀疑时，可进行IgG ELISA检测，随后用VNT确认以明确暴露史。对于血清流行病学研究，IgG ELISA是首选的筛查工具，阳性样本的子集需进行VNT确认以确保特异性。
马匹的监测系统
对马匹WNV的监测是综合监测框架的关键组成部分，旨在探测病毒循环、评估区域风险，并为兽医和公共卫生部门提供早期预警。通常依赖于三种互补的方法：被动临床监测、主动血清学监测和哨兵监测。
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被动临床监测：依赖于报告表现出与WNV感染相容的神经系统症状的马匹，并进行针对性的诊断测试。该方法成本效益高且与临床疾病直接相关，但其灵敏度受限于识别不足、报告实践不一致以及主人或兽医认知水平的差异。
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主动血清学监测：旨在通过筛查健康马群中IgG抗体的存在来检测既往暴露。横断面调查可以量化不同生态区的血清阳性率，而重复采样则能识别暴露风险的时间趋势。这种方法对于发现无临床症状的病毒“静默”循环特别有用。
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哨兵马群监测：基于对未接种疫苗的马群进行定期采样，为病毒传入或重新活跃提供了更强的早期检测能力。哨兵马匹的血清转化通常先于临床病例的发生。
为最大化流行病学洞察力，马匹监测应与更广泛的“同一健康”系统整合，纳入蚊媒监测、鸟类监测和环境数据。将马匹血清转化数据与昆虫学指数、气候指标和鸟类迁徙模式联系起来，可以更全面地理解本地传播动态。
诊断与监测面临的挑战
尽管在理解WNV流行病学和马匹感染动态方面取得了显著进展，但一些生物学、方法学和操作上的挑战仍然制约着诊断测试的准确性和监测系统的有效性。
主要的诊断限制源于WNV在马匹中感染的固有特征。马匹通常产生短暂且低水平的病毒血症，这常常低于核酸检测的分析灵敏度。因此，对血液或脑脊液进行的RT-qPCR即使在临床表现相容的病例中也常出现阴性结果。血清学检测虽然必不可少，但也引入了额外的解读复杂性。IgM捕获ELISA被认为是检测近期感染最有效的方法，但IgM反应的强度和持续时间存在个体差异，滴度可能迅速下降，导致采样延迟时出现假阴性。IgG ELISA无法区分近期与既往感染，也不能区分自然暴露与疫苗诱导的免疫。与其它黄病毒（尤其是Usutu病毒）的交叉反应进一步使血清学解读复杂化。
此外，不同国家在实验室能力、检测方法选择、临界值设定和确认程序方面存在显著异质性。这种差异影响了结果的可比性，并限制了在区域或国家层面生成统一的流行病学指标。操作上的挑战，如对神经系统症状的识别和报告不足、主动监测项目所需资金和协调的持续性，以及环境因素的快速波动，都给有效监测带来了困难。
未来发展方向
未来马匹WNV感染诊断和监测的进步将依赖于新技术的整合、诊断标准化程度的提高以及“同一健康”导向监测框架的加强。
诊断工具的改进至关重要。未来进展应侧重于开发快速、可现场部署的分子检测平台，如便携式RT-qPCR装置、基于CRISPR的检测系统或环介导等温扩增技术（LAMP）。同时，血清学工具需要改进，以克服与相关黄病毒的交叉反应问题，并更好地区分近期感染与既往暴露或疫苗诱导的抗体。
实验室方法的区域标准化也同等重要。目前ELISA临界值、确认性测试策略以及病毒中和试验的可及性存在显著差异。合作验证研究、统一的方案和共享的质量保证计划将增强诊断结果的可比性。
从监测角度看，扩展整合的多源监测系统是一个重要方向。将马匹血清学数据与蚊媒监测、鸟类检测、气候指标和生态模型联系起来，可以显著提高早期预警能力。结合远程传感、机器学习和基于气候的预测模型，可以支持高风险区域的识别、优化采样策略并指导及时的媒介控制干预。
此外，基因组监测预计将发挥越来越重要的作用。对WNV阳性样本进行高通量测序，即使覆盖率较低，也能阐明病毒谱系动态、追踪地理传播并检测与毒力、宿主适应或免疫逃逸相关的新发突变。
长远来看，需要在对培训、基础设施和跨部门合作方面进行结构性投资。加强兽医实验室、公共卫生机构、野生动物监测项目和环境监测系统之间的沟通，对于实施“同一健康”战略至关重要。
结论
WNV感染对马匹健康仍然是一个重要且不断演变的威胁，其影响超出了兽医学范畴，延伸到更广泛的“同一健康”领域。马匹作为哨兵物种，其临床和血清学反应为探测环境中病毒循环的变化提供了一种实用手段，使得马匹监测成为综合监测系统中必不可少的一环。
尽管近年来对欧洲WNV流行病学的理解取得了显著进展，但在诊断实践和监测实施方面仍存在重大差距。马匹感染所特有的短暂低水平病毒血症限制了分子检测在临床病例中的应用价值，导致仍需依赖血清学检测。然而，与其他黄病毒的交叉反应、IgM动力学的可变性以及区分自然感染与疫苗免疫的困难，使得血清学解读变得复杂。
欧洲的监测系统近年来有所扩展，但各国之间仍存在显著异质性。实验室能力、采样频率、病例定义和报告结构的差异阻碍了可比性，并削弱了早期预警能力。将马匹数据与蚊媒监测、鸟类监测和环境指标相整合，是迈向更准确风险评估和预测能力的关键一步。
展望未来，投资于诊断创新（包括快速现场检测工具、改进的血清学检测和谱系特异性分子检测）对于加强现场检测水平至关重要。同样，需要能够纳入建模、遥感和基于气候预测的自适应监测框架，以应对在不断变化的生态条件下WNV传播日益动态的特性。
总之，提高诊断性能、标准化监测协议以及更系统地将马匹数据嵌入“同一健康”系统，对于改进疫情检测、响应效率和未来WNV传播季的防范至关重要。
