利用酯化反应实现治疗性多肽的可逆高分子复合：一种增强递送稳定性的策略

《ACS Macro Letters》：Reversible, Polymeric Complexation of Therapeutic Peptides Using Esterification

本文针对弱电荷、亲水性治疗多肽难以与高分子载体复合递送的问题，开展了利用可逆酯化修饰策略增强其与聚阴离子（PMAA）复合的研究。研究证实，多肽αCT1111的酯化可增加其净电荷和疏水性，实现可逆复合，而酯键在生理条件下水解可促进多肽释放。该策略为优化此类多肽的药物递送系统，克服体内循环半衰期短的瓶颈，提供了新思路。

在生物医药领域，治疗性多肽融合了小分子药物的易合成、储存和运输特性，以及生物制剂的内源性本质和高活性优势。从调节血糖的胰岛素，到控制体重的明星药物司美格鲁肽（Ozempic），多肽药物展现出巨大的临床应用潜力。然而，这类药物在体内普遍面临两大“天敌”：酶降解和肾脏过早滤过，导致其循环半衰期极短，严重制约了其临床疗效的发挥。

为了延长多肽在体内的“驻留时间”，科学家们常常借助递送载体，例如聚电解质复合物。这类载体通常通过静电作用和疏水作用力，在温和的水相环境中实现对多肽的包裹，从而避免蛋白质变性，并具备高度的可调控性。然而，这一策略对多肽本身“性格”颇为挑剔。它更偏爱那些电荷高、个头大（如蛋白质）或疏水性强的“乘客”，对于那些电荷低、亲水性强、个头小的多肽（例如α_αCT₁₁）则常常“拒载”。强行对多肽进行永久性化学修饰，例如增加其电荷或疏水性，虽可促使其“上车”，但可能改变其活性结构，甚至在抵达“目的地”时难以释放。那么，有没有一种方法，能“暂时”改变多肽的性质，使其能被载体稳定装载，在运输途中得到保护，到达目标地点后又“恢复原貌”、顺利释放呢？

美国化学会期刊《ACS Macro Letters》发表的一项研究，为解决这一难题提供了一个巧妙的方案。该研究以具有心脏保护和伤口愈合活性的9肽αCT₁₁为模型药物。αCT₁₁序列为RPRPDDLEI，仅含2个疏水残基，净电荷为-1，是典型的弱电荷、亲水性多肽。研究人员借鉴了可逆化学修饰的思路，对其羧基进行了多位点酯化修饰，得到全酯化产物αCT₁₁-4OMe。这一“变装”策略可谓一举两得：其一，将带负电的羧基转化为中性酯基，使多肽净电荷从-1跃升至+3；其二，酯基的引入也增加了多肽的疏水性。电荷和疏水性的双重提升，为αCT₁₁与带负电的聚合物——聚(甲基丙烯酸)（PMAA）——通过静电和疏水作用力形成复合物铺平了道路。最关键的是，酯键在生理条件下可缓慢水解，最终将多肽“变回”原始的、具有活性的羧酸形式，从而实现复合、保护、递送、释放的全过程。

本研究综合运用了浊度测定、光学与透射电子显微镜、液相色谱-四极杆飞行时间质谱以及反相高效液相色谱等技术，系统评估了复合物的形成、稳定性、解离动力学，并深入探究了潜在的副反应。

监测酯化多肽的时间依赖性复合

通过比较等电点混合的酯化多肽/聚合物与未酯化多肽/聚合物混合物的浊度变化，研究人员证实了酯化是诱导复合的关键。结果显示，酯化多肽与PMAA的混合物在初期浊度显著高于对照组，表明复合物形成。在随后的4.5-10小时内，浊度开始下降，提示复合物因酯键水解而开始解离。光学显微镜观察到5-75微米的不规则大颗粒，透射电镜则显示了初始时相互连接的纳米级网状结构，这些均在22小时后基本消失，与浊度测量的复合-解离过程一致。为排除其他可能，对照实验证明单独的多肽或聚合物均不发生显著聚集，且浊度下降并非由复合物重力沉降引起。

天冬氨酸亚胺形成对复合的影响

研究人员在浊度曲线上观察到一个有趣的非单调现象：浊度在4.5小时左右出现了一个峰值，而非预期的单调下降。通过液相色谱-质谱追踪水解中间体，他们发现了一个比完全酯化多肽（αCT₁₁-4OMe）疏水性更强的物种，经鉴定为αCT₁₁-3OMe-1imide（含3个酯和1个亚胺）。研究表明，在酯水解过程中，天冬氨酸酯可先形成高疏水性的天冬氨酸亚胺中间体，再进一步水解为酸。这些高疏水性中间体在2-6小时内丰度达到最高，恰好对应了浊度峰值出现的时间窗，表明亚胺的形成促进了复合物的聚集，暂时增强了复合稳定性，延缓了解离。为了验证这一点，研究者将αCT₁₁中的天冬氨酸（D）替换为不易形成亚胺的谷氨酸（E）。结果显示，在碱性条件下，这种谷氨酸变体（RPRPEELEI-4OMe）与聚合物形成的复合物浊度更高且不随时间下降，进一步强调了疏水性在稳定复合物中的核心作用。

胺解反应对复合的影响

另一种可能增加浊度的副反应是肽的N端胺基对聚合物末端的胺解反应，该末端基团来源于RAFT聚合中使用的链转移剂。胺解可能产生疏水性更强的偶联产物。然而，实验表明，用抗胺解的异丁腈末端基团替换聚合物原有的芳香族链转移剂末端后，与酯化多肽混合完全不产生浊度，说明这个疏水性末端基团本身对复合至关重要。但用带有相同胺反应性末端的模型小分子与多肽反应，并未引发浊度增加，且UV-Vis光谱未检测到胺解特征信号。相反，用过量的小分子胺（己胺）作为阳性对照，可快速诱导聚合物颜色变化和光谱特征改变。这些证据表明，在实验条件下（3.3 mM胺，水溶剂），显著的胺解并未发生。因此，聚合物末端的芳香族疏水基团是通过疏水组装促进复合，而非通过胺解化学反应。

溶液条件和聚合物长度对复合的影响

为探究如何调控复合体系的性能，研究人员系统地改变了溶液条件和聚合物参数。盐浓度是决定静电作用的关键，将磷酸钾缓冲液浓度从38 mM加倍至76 mM完全抑制了复合物的形成。在恒定电荷比例下，多肽和聚合物的浓度与最终浊度成正比。将聚合物链长从23个单元（PMAA₂₃）增至32个单元（PMAA₃₂）仍能形成复合物，表明聚合物链长本身是复合的重要因素。更有趣的是，缓冲液类型显著影响复合物稳定性和水解速率。在相同盐浓度和pH下，使用两性离子缓冲液HEPES形成的复合物浊度是磷酸钾缓冲液中的3倍以上，且24小时内浊度不显著下降，对应更慢的水解速率。MOPS缓冲液中的结果则介于两者之间。这揭示了一个精细调控解离时间尺度的新维度。

综上所述，这项研究开创性地利用可逆酯化策略，成功解决了弱电荷、亲水性治疗多肽（以αCT₁₁为例）难以与聚阴离子载体形成稳定、可控复合物的难题。通过暂时性增加多肽的净电荷和疏水性，实现了其在生理条件下的可逆复合与程序性解离。研究明确了疏水性是调控复合物稳定性和解离动力学的核心变量：多肽侧链（天冬氨酸酯vs.谷氨酸酯）、水解中间体（天冬氨酸亚胺）以及聚合物末端基团的疏水性，共同决定了复合行为。此外，通过调整盐浓度、反应物浓度、聚合物链长乃至缓冲液类型，均可实现对复合物寿命的精细“裁剪”。这项工作不仅为αCT₁₁这类有前景的多肽药物提供了延长体内半衰期、增强疗效的递送新方案，其“可逆修饰促进可逆复合”的核心思想，也为更广泛的难以递送的亲水性生物大分子药物的剂型设计，提供了通用性强且极具潜力的新思路。