评估靛蓝介导的PCR抑制机制，并验证基于纳米技术的缓解方法在法医STR分析中的应用

《International Journal of Legal Medicine》：Evaluating the mechanism of indigo-mediated PCR inhibition and validation of nano-based mitigation for forensic STR profiling

本研究通过分子对接、动力学模拟及实验分析，揭示了靛蓝抑制PCR的三角模式机制，包括Mg2?螯合、DNA插入及π-π共轭淬灭荧光，并开发BSA包被金纳米颗粒技术有效恢复扩增效率，为染料污染DNA检测提供新方案。

摘要

靛蓝是一种天然存在的染料，目前被大量合成用于现代纺织领域。研究发现，靛蓝是一种强效的聚合酶链反应（PCR）抑制剂。本研究采用多种方法（包括计算机模拟、光谱分析和扩增实验）来探讨其抑制作用的分子机制。分子对接和动力学模拟表明，靛蓝优先结合到Taq DNA聚合酶的催化裂隙中（结合自由能为-8.916 kcal/mol），从而形成稳定的Mg²⁺辅助的相互作用和盐桥，并与关键残基（Asp610、His784、Lys663、K831）相互作用。这些相互作用导致DNA结合位点被阻塞，进而干扰了酶的催化活性。色氨酸荧光淬灭实验（K_d = 616 ± 3.7 μM）证实了靛蓝在聚合酶作用位点附近的适度亲和力。在TH01、D3S1358、D16S539、D13S317、D18S51、vWA、TPOX、D8S1179和FGA等位点上，PCR扩增受到显著抑制，峰高降低了多达60%，整体信号强度也显著减弱（PHR < 0.30）。从机制上看，靛蓝通过Mg²⁺的螯合、DNA插入以及π–π共轭作用引发三种抑制方式，共同降低了聚合酶的活性和检测灵敏度。与游离的牛血清白蛋白（BSA）相比，涂有BSA的金纳米颗粒显著提高了扩增产率和等位基因平衡的恢复效果。游离BSA需要高浓度才能部分缓解抑制作用，并且性能具有批次依赖性；而涂有BSA的金纳米颗粒由于表面反应性更强、催化稳定性更高以及能有效螯合抑制剂，在亚微摩尔浓度下仍能保持稳定的扩增效果。本研究将靛蓝确定为一种多途径的PCR抑制剂，并提出了一种基于纳米PCR的实用方案，可用于处理被染料污染的DNA样本。

图形摘要

靛蓝是一种天然存在的染料，目前被大量合成用于现代纺织领域。研究发现，靛蓝是一种强效的聚合酶链反应（PCR）抑制剂。本研究采用多种方法（包括计算机模拟、光谱分析和扩增实验）来探讨其抑制作用的分子机制。分子对接和动力学模拟表明，靛蓝优先结合到Taq DNA聚合酶的催化裂隙中（结合自由能为-8.916 kcal/mol），从而形成稳定的Mg²⁺辅助的相互作用和盐桥，并与关键残基（Asp610、His784、Lys663、K831）相互作用。这些相互作用导致DNA结合位点被阻塞，进而干扰了酶的催化活性。色氨酸荧光淬灭实验（K_d = 616 ± 3.7 μM）证实了靛蓝在聚合酶作用位点附近的适度亲和力。在TH01、D3S1358、D16S539、D13S317、D18S51、vWA、TPOX、D8S1179和FGA等位点上，PCR扩增受到显著抑制，峰高降低了多达60%，整体信号强度也显著减弱（PHR < 0.30）。从机制上看，靛蓝通过Mg²⁺的螯合、DNA插入以及π–π共轭作用引发三种抑制方式，共同降低了聚合酶的活性和检测灵敏度。与游离的牛血清白蛋白（BSA）相比，涂有BSA的金纳米颗粒显著提高了扩增产率和等位基因平衡的恢复效果。游离BSA需要高浓度才能部分缓解抑制作用，并且性能具有批次依赖性；而涂有BSA的金纳米颗粒由于表面反应性更强、催化稳定性更高以及能有效螯合抑制剂，在亚微摩尔浓度下仍能保持稳定的扩增效果。本研究将靛蓝确定为一种多途径的PCR抑制剂，并提出了一种基于纳米PCR的实用方案，可用于处理被染料污染的DNA样本。

图形摘要