短读长全基因组测序在人群规模的应用：来自2317名患者的诊断洞察 标题说明：本研究评估了短读长全基因组测序（srWGS）作为一线诊断工具在丹麦中部地区大规模实施的情况，覆盖了多种患者群体，揭示了其在单基因疾病诊断中的可行性和不同疾病类别间的诊断率差异，为精准医疗的推广提供了重要证据。

《European Journal of Human Genetics》：Short-read genome sequencing at population scale: diagnostic insights from 2317 patients

本项研究聚焦于短读长全基因组测序（srWGS）在临床诊断中的应用挑战，即缺乏其在多种临床专科大规模实施的证据。为此，研究人员开展了针对2317名疑似单基因疾病患者的srWGS一线诊断评估。研究得出了20%的整体诊断率，揭示了不同疾病类别间诊断率的显著差异（从儿童癌症的6%到皮肤病的60%）。该研究证明了srWGS作为一线诊断工具的可扩展性，并为srWGS在临床实践中的针对性应用提供了关键数据支持。

在精准医疗的时代，寻找遗传病背后的“罪魁祸首”——致病变异，是一场艰辛的征程。对于许多患有罕见遗传病的患者及其家庭来说，这常被称为“诊断苦旅”，他们可能需要经历多次无效检查，花费数年甚至数十年才能得到明确诊断。传统的基因检测方法，如单个基因测序（Sanger测序）或目标基因面板测序，虽然有效，但往往耗时耗力，且可能因技术限制而遗漏某些类型的变异。随着测序技术的飞速发展，短读长全基因组测序（srWGS）以其能够一次性检测几乎所有基因组区域（包括编码区和非编码区）、识别从单核苷酸变异到结构变异等多种变异类型的优势，被视为缩短这场苦旅的“利器”，并逐渐从研究走向临床。然而，尽管前景广阔，一个核心问题依然悬而未决：当srWGS作为一种常规的一线诊断工具，在大规模、多样化的真实世界患者群体中推广时，其实际表现究竟如何？不同疾病领域的诊断成功率有多大差异？其推广实施又会面临哪些实际的临床和技术挑战？

为了回答这些问题，丹麦的研究团队在丹麦国家基因组中心（DNGC）的框架下，在丹麦中部地区进行了一项大规模、前瞻性的临床实施研究。他们评估了从2021年到2024年间，对2317名来自广泛医学专科的疑似遗传病患者实施srWGS的诊断效果。该研究旨在评估其可扩展性，并描绘出在不同患者群体中的诊断“收益率图谱”，以指导未来的临床应用决策。这项研究于近期发表在《European Journal of Human Genetics》上，为我们提供了一个在国家卫生系统内规模化应用基因组学的宝贵案例。

主要研究方法简述：该研究是一项观察性队列研究。研究人员对2317名获得知情同意的患者进行了Illumina平台的srWGS。DNA提取自外周血，文库制备使用Illumina无PCR（PCR-Free）建库法，在NovaSeq 6000或NovaSeq X+平台上进行测序。生信分析基于hg38参考基因组，使用GATK HaplotyperCaller等进行变异检出，并使用多种工具（如DELLY、Manta、TIDDIT、CNVpytor）检测结构变异。患者根据表型和年龄被分为不同的临床亚组，以支持靶向的变异过滤和解读。变异根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南分为C1-C5级。诊断率定义为检出“解释性发现”（即与患者表型匹配、且符合预期遗传模式的C4或C5级致病/可能致病变异）的报告所占百分比。研究还对不确定发现（C3级变异）和次要发现（与当前表型无关的C4/C5级变异）的报告情况进行了分析。伦理方面，所有患者均签署了包含次级发现报告选择权的书面知情同意书。样本队列来自丹麦中部地区临床转诊的疑似单基因疾病患者。

研究结果

srWGS的实施：

在45个月的研究期间，共完成了2317名先证者的srWGS和临床报告。研究发现，不同临床专科对srWGS的采纳速度存在显著差异。例如，遗传性心脏病和儿童罕见病是最早广泛应用srWGS的领域，而精神疾病和肾病等领域则应用较少。研究期间，每个样本的测序成本显著下降，从1150美元降至475美元，这使得srWGS在临床上更具经济可行性。这证明了在公共医疗系统中规模化运行srWGS诊断流程的可行性，但不同专科的采纳壁垒（如既往检测习惯、临床工作流程整合需求）会影响其实施进度。

诊断率：

研究计算的整体诊断率为20%，但不同患者类别间存在巨大差异。诊断率最高的类别是遗传性皮肤病，达到60%。而诊断率最低的类别是儿童癌症，仅为6%。其他类别如儿童罕见病（29%）、成人罕见病（23%）、神经遗传病（20%）、内分泌疾病（12%）等诊断率各不相同。研究还计算了“部分发现”（即在隐性致病基因中仅找到一个杂合致病/可能致病变异）的比例，该比例在不同疾病组间也有所变化。这些数据清晰表明，srWGS的诊断效能高度依赖于具体的疾病领域，识别高诊断回报的患者群体对于优化医疗资源分配至关重要。

不确定发现和次要发现的报告：

对于不确定发现（C3级，意义未明变异）的报告实践在不同患者组中差异很大。在遗传性心脏病、先天性免疫缺陷、遗传性癌症、血液病或内分泌疾病患者中，20-50%的报告包含了不确定发现。而在其他组别，这一比例仅为3-14%。这反映了不同专科对于变异报告临床价值的权衡和可用的下游功能验证资源的差异。次要发现（与当前表型无关的致病/可能致病变异）的报告率在所有患者类别中变化较小，在0-6%之间，平均约为3%。这表明即使在非主动搜索的情况下，基于srWGS的广泛分析仍能偶然发现具有临床意义的次要遗传信息。

重点患者类别内的诊断率剖析：

研究人员进一步分析了几个重点患者群体内部的亚组情况：

• •
  罕见病队列：对所有疑似罕见病的儿童（包括畸形、神经发育或代谢性疾病等）采用基于核心家系的“三重子”（trio）分析法，诊断率为29%。对成人则采用了自定义基因面板的单人分析法，诊断率为23%。值得注意的是，骨骼发育不良亚组（儿童38%，成人50%）显示出较高的诊断率。
• •
  神经遗传病：整体诊断率为20%。其中，癫痫、神经病变或基底节疾病患者的诊断率较高（23-28%），而肌病（12%）、共济失调（16%）和遗传性痉挛性截瘫（19%）的诊断率较低。痴呆、肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆或小血管病亚组的整体诊断率仅为7%。
• •
  内分泌疾病患者：整体诊断率为12%。在八个内分泌亚组中，诊断率从器质性低血糖患者的0%到性发育障碍、单基因糖尿病和罕见甲状腺疾病患者的近18%不等。这突显了即使在同一个大疾病类别内，不同亚型间的遗传诊断复杂性也大相径庭。

研究结论与讨论

这项在丹麦中部地区实施的研究表明，将srWGS作为一线诊断工具用于广泛疾病谱系是可行且成功的，平均每五名患者中就有一人获得了分子诊断，这些发现直接指导了临床决策和遗传咨询。研究期间测序成本的大幅下降进一步巩固了srWGS在临床诊断中的经济可行性。

研究的成功实施依赖于国家专家小组的巨大努力，他们制定了标准化的患者纳入标准、实验室流程和分析方案。这种标准化虽减少了地方的灵活性，但促进了全国范围内的紧密合作和多学科交流，并为临床决策（如报告次要发现和C3级变异）提供了国家级共识支持。

然而，研究也揭示了不同医学专科采纳srWGS的差异，这受到既往检测习惯、临床工作流程整合需求、以及构建虚拟（in silico）基因面板的初始障碍等多重因素影响。新的法律框架要求对患者进行详尽的知情同意告知，这在初期消耗了大量临床资源，但同时也赋予了患者在选择是否接收次要发现信息方面的自主权。

诊断率的差异受到患者选择、分析流程设计和变异解读等多种因素影响。本研究的数据为srWGS的诊断效能提供了重要的基线参考。与英国10万人基因组计划等国际项目相比，本研究的诊断率处于可比的范围内，但具体数字的差异可能反映了队列构成的差异。值得注意的是，除了遗传性皮肤病，大部分接受检测的疑似单基因疾病患者仍未获得遗传学诊断。

未来，通过更好的基因组数据共享基础设施（如欧洲基因组数据基础设施）、更严格的患者选择以及长读长（long-read）测序等新技术的应用，有望进一步提高诊断率。长读长测序在检测重复扩展、假基因变异、甲基化差异和复杂结构变异方面具有优势。但与此同时，协调国家和国际层面的基因组数据共享法律框架，对于充分发挥这些技术的潜力至关重要。

总之，丹麦中部地区的实践证明了大规模基因组测序作为常规一线诊断工具的可行性和公平可及性。该研究获得的跨患者群体的诊断率数据，为未来优化srWGS的临床应用、合理分配资源以及为特定患者群体制定更精准的检测策略提供了关键证据，并为全球范围内推进基因组医学融入公共卫生体系树立了典范。