《Translational Psychiatry》：Beyond microtubule regulation: the multifaceted roles of tau in neuronal function and dysfunction
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这篇综述系统性地挑战了tau蛋白主要作为轴突微管稳定剂的传统观点，提出tau是一个多功能的神经元相互作用枢纽。作者基于其内在无序蛋白的特性，详细阐述了tau在神经元内外的多种定位、与微管及其他分子的动态相互作用、以及在多种信号通路中的角色。文章特别强调了在tau蛋白病中，tau获得毒性功能（而非丧失功能）可能是神经退行性疾病的关键驱动因素，为理性设计靶向tau的治疗策略（如减少其聚集或调节翻译后修饰）提供了新的理论框架。
引言
神经元微管相关蛋白tau，因其在阿尔茨海默病（AD）和一系列统称为tau蛋白病的神经退行性疾病中扮演核心角色而闻名。在这些疾病中，tau发生异常聚集，对触发细胞死亡至关重要。尽管tau最初被鉴定为能与微管共纯化的因子，但数十年研究下来，其确切的生理功能仍不明确。本综述旨在超越tau与微管的传统关联，探讨其作为多功能蛋白的复杂角色，这对于理解tau如何在疾病中获得毒性，并开发靶向tau的理性疗法至关重要。
Tau的定位
tau并非单一蛋白，而是由位于人类染色体17q21的单一基因通过选择性剪接和多种翻译后修饰产生的一系列蛋白型组成的集合。其亚型大小范围很广，从中枢神经系统胎儿期的352个氨基酸，到大多数外周神经元（如背根神经节）中的758个氨基酸（称为“Big Tau”）。
关于tau多样化角色的最初线索来自其亚细胞分布。早期免疫细胞化学研究认为tau仅局限于轴突，但后来发现，这取决于所使用的抗体特异性，总tau实际上分布于包括神经元胞体-树突区在内的多个细胞区室。这表明tau的定位强烈依赖于其翻译后修饰。迄今，tau已被发现在神经元质膜、细胞核、突触前末梢和突触后棘等位置均有分布。这些定位通常与特定的修饰状态相关，例如，与质膜相关的tau主要是去磷酸化的，而其磷酸化会阻碍这种相互作用。核定位也依赖于tau的磷酸化状态，并且核内tau在Lys174位点通常被高度乙酰化。在完整的树突棘中也观察到了高度磷酸化tau的积累。此外，tau的突触前定位似乎与其发生液-液相分离有关，而该过程可因tau磷酸化增加而增强。
tau的分布不仅限于细胞内，还在隧道纳米管（TNTs）中被发现，这是一种连接细胞的丝状膜结构。tau也能被神经元分泌到细胞外空间，很可能在生理条件下也是如此，因为其分泌依赖于神经元活性。另一方面，神经元也能摄取tau，其中低密度脂蛋白受体1（LRP1）已被确定为内吞可溶性tau所需的关键受体。tau在神经元内外的广泛定位，使其成为超越AD的潜在多功能生物标志物或治疗靶点。
微管结合与自组装
tau蛋白的名称“tubulin-associated unit”暗示了其传统功能是作为结构性微管相关蛋白（MAP）。tau与微管的相互作用区域位于其羧基端的一半，由一个18个氨基酸的重度序列构成，每个重复代表一个基本的微管结合单元。根据异构体的不同，tau包含三个（3R tau）或四个（4R tau）这样的重复序列。在基于无细胞冷冻电镜实验构建的近原子分辨率模型中，单个重复区域能连续跨越三个微管蛋白单体，横跨微管蛋白二聚体内和间的界面。在体活细胞成像实验进一步表明，一个额外的羧基端假重复区域强烈增强了tau与微管的结合。
在轴突中，tau与微管的相互作用是高度动态的。追踪神经元中的单个tau分子发现，tau在一个微管结合位点上仅停留毫秒级时间，并在同一秒内与同一根或邻近微管上的20-30个不同位点结合，这种行为被称为“kiss-and-hop”。这种动态行为解释了为何tau在轴突中浓度高达微摩尔级别，却并不影响体内轴突运输的速率。如果tau与微管的相互作用不够动态，人们会预期由于tau的广泛覆盖，至少会对依赖于马达蛋白的微管运输产生一定的空间位阻。
这种短暂的相互作用也与微管的动力学特性相关。在无细胞实验中，tau能通过增加“救援”频率（即去聚合的微管切换回生长状态的速率）来动力学地稳定微管的动态不稳定性，并稳定直原丝的形成。然而，文献中常常声称tau在神经元中稳定微管，但几乎没有实验证据支持这一点。事实上，在细胞培养或体内急性或慢性敲低tau并不影响微管的稳定性，这反而反驳了tau在轴突中具有微管稳定功能的观点。已知tau优先结合在轴突远端区域，那里主要是动态的而非稳定的微管。事实上，在培养神经元中，tau耗竭后，微管的稳定部分甚至有所增加。因此，虽然tau能促进神经突中的微管聚合，但这并不会导致轴突微管的显著稳定。tau与微管的动态相互作用可能提供了一种调控轴突微管聚合而不促进其稳定的方式。
翻译后修饰在调节tau-微管相互作用中起着重要作用。磷酸化是研究最广泛的修饰，tau拥有超过80个潜在磷酸化位点，其中许多位于微管结合区两侧的区域，这些位点在AD患者分离出的异常丝状tau聚集体（成对螺旋丝，PHFs）中也显示磷酸化增加。磷酸化可以由脯氨酸导向的蛋白激酶（如糖原合酶激酶3（GSK3）、周期蛋白依赖性激酶5（CDK5））和非脯氨酸导向的蛋白激酶（如MAP/微管亲和调节激酶4（MARK4））介导。总体而言，这些位点的磷酸化增加会降低tau与微管的相互作用，但在轴突环境中，由于微管上tau结合位点的高浓度，磷酸化的影响可能更为微妙。
除了微管相互作用，tau磷酸化对另一个潜在过程——tau的自组装——可能影响更显著。来自AD患者的高分辨率tau丝结构数据表明，丝状核心由包含微管结合区域和部分相邻羧基端假重复区域的原丝构成，呈现一种交叉β/β螺旋结构。磷酸化增加可促进tau的聚集，最近的无细胞实验表明，特别是脯氨酸导向激酶GSK3β的磷酸化，促进了全长tau的聚集，这突出了tau-微管相互作用调控与聚集之间的联系。活细胞成像研究表明，tau聚集增加与微管相互作用减少相关，可溶性的tau自组装产物（不仅是较大的tau丝）也显示出与微管相互作用的减少，这提示tau自组装程度与tau-微管相互作用之间存在直接联系。
除了磷酸化，其他翻译后修饰也能影响tau与微管的相互作用及其聚集。例如，微管结合区域内Lys280的乙酰化可抑制tau依赖的微管组装并促进tau聚集；Caspase-3在tau羧基末端区域的切割可增加其与微管的相互作用；O-GlcNAc糖基化则可能根据tau异构体的不同，差异性地调节微管结合和聚集。这些修饰增加了不同tau蛋白型与微管相互作用及自组装的复杂性。
Tau作为神经元相互作用枢纽
tau属于一个结构密切相关的MAPs家族，其成员共享一个包含微管结合重复区的保守羧基端结构域。tau与其姊妹蛋白MAP2在脊椎动物进化初期通过一个共同祖先基因的复制而产生。尽管tau和MAP2共享一个进化上高度保守的微管结合区，但两者在神经元中的分布不同：tau富集于轴突区室，而MAP2主要位于成熟神经元的胞体-树突区。这表明这两种蛋白的氨基末端部分介导了区室特异性的相互作用和功能。
tau属于内在无序蛋白（IDPs），其本质无序区域缺乏明确的三维结构，具有极大的构象灵活性，提供了巨大的相互作用表面。tau的二重结构在其内在无序程度上也很明显，与更保守的羧基端部分相比，其N端区域的无序程度显著更高。从脊椎动物进化过程中无序度的变化来看，微管结合区的无序度没有明显变化，而N端区域的无序度从无颌类动物到两栖动物再到哺乳动物急剧增加。tau的姊妹蛋白MAP2并未显示出类似的无序度增加，这表明这两种MAP发生了不同的进化。
除了微管，tau已被证明能与许多蛋白质相互作用，表明其参与了多种过程。已证实的相互作用伙伴包括热休克蛋白、突触小泡蛋白以及属于膜联蛋白家族的磷脂结合蛋白。最近通过诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元进行的邻近标记技术，系统性地获得了人类神经元中tau相互作用组的信息，鉴定出超过240个潜在的tau互作蛋白。其中近一半的蛋白仅在用氨基末端或羧基末端APEX标记的神经元中被检测到，这表明tau的微管结合区与其氨基末端投射域具有不同的结合伙伴。N端APEX标记的tau相互作用组包括了参与突触后组织的蛋白，暗示tau具有突触前和突触后功能，这与tau在突触前、突触后棘以及质膜的定位数据一致。核定位也通过RNA和DNA结合蛋白的检测得到证实。
tau不同区域特异性的直接信息来自对相互作用伙伴结合位点的图谱分析。氨基末端投射区主要与脂质结合蛋白和突触小泡蛋白相关。对于tau在轴突区室富集，其与膜联蛋白（如AnxA2和AnxA6）的结合可能很重要。tau与肽基-脯氨酰异构酶Pin1的相互作用在生理和病理条件下也可能具有功能重要性，Pin1识别tau脯氨酸富集区（微管结合区氨基端侧翼）的磷酸化Thr212-Pro213位点。tau与14-3-3蛋白的磷酸化依赖性相互作用也已被观察到，14-3-3蛋白是一个参与细胞凋亡、信号转导等重要过程的磷酸丝/苏氨酸结合蛋白家族。这一发现表明tau能以磷酸化依赖的方式调节关键的细胞信号通路。与tau的氨基末端区域类似，14-3-3蛋白广泛的相互作用也由其本质无序蛋白区域所促进，这暗示了两个本质无序蛋白作为细胞信号通路调控中的关键伙伴关系。相比之下，tau的羧基端区域主要涉及与热休克蛋白、微管、肌动蛋白丝的结合，以及如前所述的tau自组装。
因此，tau在电荷分布和本质无序区域存在方面的二重结构，反映了其二重的相互作用组和假定的功能。值得注意的是，tau的细胞功能在经过数十年的研究后仍不清楚。目前似乎只有一点是确定的，即tau具有相关功能，因为迄今为止所有已完成基因组测序的脊椎动物都至少含有一个tau基因。
来自tau敲低研究的启示
分析tau敲除或敲低动物模型的后果，可能有助于阐明tau蛋白的生理功能。然而，研究结果并不一致，特别是在遗传性减少或完全敲除MAPT基因（编码tau）的小鼠模型中。基于早期的细胞研究（其中用反义寡核苷酸降低tau表达会抑制原代神经元的神经突生长和轴突特化），人们可能预期tau敲除小鼠无法存活。然而，Harada等人在20世纪90年代报告了可存活的tau敲除小鼠，其仅表现出轻微的表型，如小口径轴突中微管组织改变。值得注意的是，从这些小鼠培养的神经元中未观察到轴突延伸的显著损伤。随后的tau敲除模型也可存活，仅显示出轻微的神经突成熟发育迟缓。
虽然一些研究甚至表明，在神经和精神疾病模型中，tau缺失具有积极效应，并能缓解轻度创伤性脑损伤后的空间学习缺陷，但其他研究并未发现保护作用。例如，在一些Aβ病理模型中，tau敲除可防止突触功能障碍和认知障碍，而另一些模型则未发现tau敲除能对抗Aβ沉积或突触可塑性缺陷。在帕金森病模型中也观察到了类似的不一致性。一些研究中tau缺失减少了α-突触核蛋白病理，而其他实验则报告tau敲除在缓解多巴胺能神经元丢失或α-突触核蛋白包涵体形成方面没有益处。
利用电生理记录评估神经元功能也存在争议。一组观察到长时程增强（LTP）显著受损，但长时程抑制（LTD）正常；而另一项研究则报告了相反的电生理学结果，显示LTD选择性受损。行为学研究的结果也存在矛盾。一项研究报告运动技能、探索行为和焦虑样表型正常，而多项研究显示tau敲除小鼠运动功能受损，另一些研究报告了焦虑相关行为和情境/线索恐惧记忆缺陷。多个tau敲除模型中一个较为一致的表型是周围神经髓鞘形成缺陷，这可能表明大tau异构体在周围神经系统中具有稳健的作用。
这些看似矛盾的结果可能源于几个因素，包括所用小鼠品系的遗传背景差异、研究时小鼠的年龄以及产生tau敲除小鼠的具体方法。尽管考虑了这些变量，不一致性仍然存在。这些不同的结果凸显了评估tau作用的复杂性，以及对tau敲除模型结果需谨慎解读的必要性。一些差异也可能源于敲除情景中基因表达的代偿机制。先前的研究已表明tau在调节基因表达中起作用（这也与其核定位一致），最近的转录组学和磷酸化蛋白质组学分析揭示了tau敲除小鼠脑中基因表达和信号通路的复杂改变。还应该考虑到，这些效应中的许多可能也具有物种依赖性，在人类大脑中调节tau表达可能产生不同的后果。
疾病中的tau：获得毒性
tau这种能与微管及多种信号通路成分相互作用的蛋白，其敲低或缺失在系统背景下似乎仅有细微影响，这有些令人惊讶。这使得tau对神经退行性疾病发展的核心贡献不太可能源于其功能丧失效应。文献中仍经常声称存在一系列事件，即tau在疾病期间磷酸化增加，导致其与微管相互作用丧失，进而导致微管去稳定化和解聚，最终导致受影响神经元死亡。然而，缺乏支持这种事件序列的证据，原因如下：首先，tau在神经元环境中似乎并不稳定微管；其次，tau的丢失并不会显著损害神经元存活。
另一种假设得到了实验更好的支持：疾病修饰的tau获得了导致神经变性的毒性特性。支持“获得毒性功能”假说的初步证据来自实验，其中在神经元分化的PC12细胞和终末分化的人类CNS模型神经元中表达疾病样修饰的tau，该tau构建体在未检测到高级蛋白聚集物的情况下，就发挥了细胞毒性作用，并诱导了凋亡性细胞死亡和Caspase-3激活。值得注意的是，毒性发生在没有可检测到的高级蛋白聚集体的情况下，这表明潜在错误折叠的可溶性tau物种，而非更高级的丝状tau聚集体，代表了有毒物种。
事实上，多项研究表明，可溶性tau或可溶性tau寡聚体的功能障碍是tau蛋白病中最具毒性的物种，其毒性远高于较大的纤维状聚集体。一项研究发现，经超声处理产生的小型有毒寡聚体，而非稳定的纤维状结构，具有高度细胞毒性。此外，当将tau寡聚体注射到野生型小鼠大脑中时，观察到认知、突触和线粒体异常，来自各种tau蛋白病的脑源性tau寡聚体已被证明会影响神经元功能、基因调控和疾病进展。可溶性tau物种的毒性先于更大聚集体的形成，这一观点也得到了以下发现的支持：AD患者的神经元丢失超过了神经原纤维缠结（NFTs）的分布，并且tau寡聚体形成的增加发生在更高阶tau聚集体形成之前。另一方面，至少在动物模型中，体内携带NFTs的神经元已被证明功能完整，这表明在NFTs发展与区域特异性神经元丢失之间存在简单的相关性是不正确的。相反，数据表明，NFTs的形成可能是受影响神经元为减少有毒可溶性tau物种的数量而形成生物学惰性聚集体的一种挽救机制。
tau“获得毒性功能”的假说也得到了一些细胞和动物实验的支持，在这些实验中，降低tau水平可提供保护作用。这包括多种疾病，如Aβ诱导的tau病理、自闭症的行为症状、发育性癫痫病、应激相关的脑病理和慢性疼痛，表明tau积极参与了多种疾病的发生和持续，并涉及许多细胞过程。例如，应激激素水平升高已被证明可促进tau分泌和跨神经元传播，而暴露于慢性疼痛似乎会触发tau错误折叠和聚集。
tau敲除研究表明，tau也可能参与成年海马神经发生（AHN）。虽然人类AHN的发生和相关性仍存在争议，但有证据表明AHN受损可能是早期AD的一个特征。慢性应激以tau依赖的方式降低了小鼠模型的海马神经发生，磷酸化tau在GABA能中间神经元中的积累损害了AHN，这证实了tau在生理和病理条件下对海马神经发生的贡献。
考虑到tau在神经元功能中的多样化作用，tau在疾病进展中获得毒性特性很可能是多方面的。功能受损最明显的候选者是微管调节，因为微管是tau的主要相互作用伙伴。然而，考虑到微管在各种细胞过程中的核心作用，很难区分tau与微管相互作用受损的直接影响与其他因素和信号机制改变介导的间接影响。tau与微管的相互作用是高度动态的，正如其在轴突微管上的“kiss-and-hop”相互作用所展示的那样。由于这种动态相互作用是tau不阻碍微管依赖性运输所必需的，因此获得毒性特性可能导致微管相互作用的动力学受损，从而导致轴突运输缺陷。事实上，Caspase-3在tau极端羧基末端的切割产生了一种截短的tau形式（TauC3），它在微管上的停留时间更长，导致运输效率降低和树突萎缩的发展。有趣的是，在衰老小鼠的海马中，在Caspase-3位点被切割的tau比例增加了一倍，TauC3在AD患者中也增加。这表明了一种毒性功能获得机制，其中tau的翻译后修饰改变了tau-微管相互作用的动力学，从而导致轴突运输缺陷和神经元变性。
不同tau异构体之间平衡的改变也可能导致微管依赖性毒性。成年人类大脑包含等量的具有四个（4R tau）或三个（3R tau）微管结合域重复的tau异构体，它们因外显子10（E10）的存在与否而不同。任何一方的3R/4R比例失衡都可能导致tau蛋白病，正如已知的与E10剪接相关的致病突变所表明的那样。事实上，tau异构体失衡损害了人类神经元中的轴突运输，调节tau异构体失衡减少了小鼠的tau病理和认知衰退。
已确定了几种其他潜在的tau毒性机制，这些机制很可能与不依赖于微管的tau相互作用有关。其中包括tau依赖的Src激酶Fyn突触后靶向的改变（这会减弱Aβ毒性）、突触小泡结合的异常（导致tau诱导的突触毒性）以及tau寡聚体诱导的突触和线粒体功能障碍。综上所述，这些数据表明tau毒性特性的增加与其多样化的tau相互作用被破坏有关。这包括一方面tau的羧基端微管结合半部分的相互作用（tau-微管相互作用和tau-tau关联），另一方面是氨基末端投射域与膜组分、突触蛋白和信号级联成员的相互作用。另一方面，值得指出的是，高度磷酸化的tau也能通过稳定β-连环蛋白来介导抗凋亡作用，β-连环蛋白是一种参与调节和协调细胞间接触和基因转录的双功能蛋白。这表明tau相互作用改变会产生复杂的后果，在药物开发中应予考虑。
最后，还应考虑到病理改变的tau的毒性特性并不局限于单个神经元，还可以通过多种非排他性机制在神经元之间传播。这些机制可以包括直接穿过质膜的非常规分泌。
