转录因子OsWRKY64与OsART1互作正调控水稻铝抗性

《Plant Biotechnology Journal》：The Transcription Factor OsWRKY64 Interacts With OsART1 to Positively Regulate Al Resistance in Rice

铝（Al）是酸性土壤中限制作物生长的关键毒性因子。水稻铝抗性转录因子OsART1是调控耐铝机制的核心，但其转录后调控机制尚不明确。本研究通过酵母双杂交筛选，鉴定出与OsART1互作的WRKY转录因子OsWRKY64，并系统揭示了其在铝胁迫下的表达特性、蛋白互作机制及其对OsART1稳定性与转录活性的正向调控作用。结果表明，OsWRKY64能增强OsART1蛋白稳定性，促进其下游抗铝基因（如OsALS1、OsSTAR1、OsFRDL4）表达，进而提升水稻铝抗性。此外，OsART1亦能直接结合OsWRKY64启动子，形成正反馈调节环路。该研究不仅阐明了OsWRKY64-OsART1模块在水稻铝抗性中的关键作用，也为耐铝水稻品种的分子育种提供了新靶点。

　　

酸性土壤约占全球可耕地的40%，其中铝（Al³⁺）是主要的毒性离子，严重抑制植物根系生长，影响作物产量。水稻（Oryza sativa）作为重要粮食作物，对铝具有相对较高的耐受性，这主要归功于其体内复杂的抗铝机制。铝抗性转录因子1（ART1）是水稻响应铝胁迫的核心调控因子，能直接激活多个下游抗铝基因的表达。然而，铝胁迫并不影响OsART1的转录水平，暗示其可能受到转录后或翻译后层面的调控，但这一过程的分子细节长期未明。为解析OsART1的转录后调控网络，研究人员开展了系统性研究，相关成果发表在《Plant Biotechnology Journal》上。

研究人员首先通过酵母双杂交筛选，以OsART1为诱饵，从水稻cDNA文库中鉴定出与其互作的WRKY家族转录因子OsWRKY64。随后，综合运用分子互作验证、遗传表型分析、基因表达检测、蛋白稳定性测定以及转录活性评估等多种技术手段，深入探究了OsWRKY64在铝胁迫应答中的功能及其与OsART1的调控关系。

2 Results

2.1 OsWRKY64 and OsART1 Interact Both In Vivo and In Vitro

通过酵母双杂交、免疫共沉淀、分裂荧光素酶互补及体外Pull-down实验，研究人员证实OsWRKY64与OsART1在体内外均能发生直接的物理相互作用。

2.2 OsWRKY64 Positively Regulates the Al Tolerance in Rice

利用CRISPR/Cas9技术创制了oswrky64功能缺失突变体，并构建了OsWRKY64过表达株系。表型分析发现，oswrky64突变体在铝处理下根系伸长受抑制更严重，根尖胼胝质沉积和铝积累增多，表现出铝敏感表型；而过表达株系则表现出更强的铝抗性，根尖铝积累减少。这些结果证明OsWRKY64是水稻铝抗性的正向调控因子。

2.3 Al Induces OsWRKY64 Transcription and Protein Accumulation in Root Tips

表达模式分析表明，OsWRKY64主要在水稻根部表达，尤其在根尖。其转录水平和蛋白积累量均能被铝胁迫显著且快速地诱导。

2.4 OsWRKY64 Belongs to the Category of Nuclear-Localised Transcription Factors

亚细胞定位显示OsWRKY64定位于细胞核，并具有转录激活活性。基因表达分析发现，oswrky64突变体中多个OsART1下游靶基因（OsALS1、OsSTAR1、OsFRDL4）的表达下调，而过表达株系中这些基因表达上调。酵母单杂交和荧光素酶报告基因实验表明，OsWRKY64并不能直接结合这些靶基因的启动子，暗示其调控是间接的。

2.5 OsWRKY64 Positively Regulates OsART1 Protein Accumulation and Accelerates the Transcriptional Activity of OsART1

体外细胞降解实验表明，OsWRKY64能够显著延缓OsART1蛋白的降解，提高其稳定性。相反，OsART1并不影响OsWRKY64的稳定性。此外，在原生质体共转实验中，OsWRKY64能协同增强OsART1对其下游靶基因（OsALS1、OsSTAR1、OsFRDL4）启动子的转录激活能力。

2.6 OsART1 Directly Modulates OsWRKY64 Expression

研究人员发现，osart1突变体中OsWRKY64的铝诱导表达被完全抑制，而在OsART1过表达株系中其表达增强。通过酵母单杂交、荧光素酶报告基因及凝胶阻滞实验证实，OsART1能够直接结合OsWRKY64启动子上的特异顺式作用元件，从而正向调控其转录。

3 Discussion

综合上述结果，本研究揭示了OsWRKY64-OsART1调控模块在水稻铝胁迫应答中的核心作用与分子机制。OsWRKY64受铝诱导表达后，通过与OsART1互作，一方面稳定OsART1蛋白，另一方面增强其转录激活活性，从而共同促进下游抗铝基因的表达，提高水稻铝抗性。尤为重要的是，OsART1又能直接激活OsWRKY64的转录，二者形成了一个精密的正反馈调节环路。这一环路可能对维持细胞内OsART1蛋白水平的稳态、实现快速高效的铝胁迫响应至关重要。

该研究首次系统阐明了WRKY转录因子OsWRKY64通过调控OsART1的稳定性与功能来影响水稻铝抗性的新机制，加深了对植物抗铝转录后调控网络的理解。研究结果为利用基因工程手段（如过表达OsWRKY64）培育适应酸性土壤的耐铝水稻新品种提供了重要的理论依据和候选基因靶点，对保障全球粮食安全具有潜在的积极意义。