《Advanced Science》：De Novo Design and Directed Evolution Refinement of Mirror-Image Protein Binders Targeting Interleukin-4
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为解决当前靶向白细胞介素-4 (IL-4)的生物制剂存在稳定性与特异性局限的问题，研究人员开展了“De Novo Design and Directed Evolution Refinement of Mirror-Image Protein Binders Targeting Interleukin-4”主题的研究。他们通过整合从头计算设计、酵母展示筛选和定向进化，并结合WALTZ预测工具优化蛋白溶液行为，成功开发出能高效结合并抑制天然IL-4的D-蛋白抑制剂D-18252-evo。该D蛋白表现出纳摩尔级结合亲和力(~87 nM)、高热稳定性、抗蛋白酶降解能力，并能有效阻断IL-4/IL-4Rα相互作用及下游STAT6磷酸化和细胞增殖信号通路。此工作建立了一种可扩展的、用于生成稳健镜像蛋白疗法的理性设计框架，为治疗过敏性疾病、哮喘和癌症等IL-4驱动的疾病提供了具有增强稳定性和靶向功效的新一代治疗平台。
在免疫系统和疾病治疗的战场上，细胞因子IL-4 (Interleukin-4) 扮演着一个关键而复杂的角色。它像一把双刃剑，一方面在正常的Th2型免疫应答中不可或缺，另一方面，当其信号通路过度活跃时，则会驱动过敏性皮炎、哮喘等一系列恼人的过敏性疾病，甚至在肿瘤微环境中帮助癌细胞逃避免疫系统的攻击，导致癌症治疗抵抗。因此，长期以来，IL-4被视为一个极具潜力的药物靶点。然而，针对它的“武器”开发却屡屡受挫。传统的单克隆抗体，如靶向IL-4Rα的Dupilumab虽已获成功，但直接中和IL-4本身的抗体（如pascolizumab）在临床试验中表现平平。小分子抑制剂则因亲和力低、细胞效力有限而进展缓慢。这些疗法普遍面临着稳定性、特异性或体内半衰期等方面的挑战。
有没有一种全新的分子，既能精确“擒获”IL-4，又能拥有“金刚不坏之身”，抵抗体内各种酶的降解，实现长效稳定的治疗呢？科学家们将目光投向了自然界中罕见的一类分子——镜像蛋白 (D-proteins)。与构成生命体绝大多数蛋白质的L-氨基酸不同，D-蛋白完全由D-氨基酸构成，它们是天然蛋白质在三维空间中的“镜像”。这种独特的化学结构赋予了D-蛋白非凡的优势：极低的免疫原性、卓越的抗蛋白酶降解能力，以及由此带来的延长的体内半衰期。此前，通过“镜像噬菌体展示”等随机筛选方法，科学家们已能获得一些D-蛋白结合剂，但这种方法像“大海捞针”，无法精确控制结合剂靶向的位点（表位），也常常无法兼顾分子的结合力与自身的“品行”（如是否容易聚集沉淀）。
为了解决这些难题，发表在《Advanced Science》上的一项研究报道了一种全新的理性设计策略。研究人员不再依赖随机筛选的运气，而是将计算生物学的前沿工具与经典的实验进化手段深度融合，成功设计并优化出了一种能高效靶向人IL-4的D-蛋白抑制剂。他们建立了一个可扩展的框架，为开发下一代具有增强稳定性的细胞因子靶向疗法铺平了道路。
为开展此项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。首先，他们基于IL-4与其受体IL-4Rα/IL-13Rα1的复合物晶体结构 (PDB: 3BPN)，通过计算镜像获得了D-IL-4的理论模型，并针对其受体结合表位，利用RifGen/RifDock和Rosetta套件进行了L-蛋白结合剂的从头计算设计。随后，他们将设计出的数千个L-蛋白序列构建成酵母表面展示 (yeast surface display) 文库，利用化学合成的D-IL-4作为“诱饵”，通过多轮荧光激活细胞分选 (FACS) 进行高通量筛选，并结合下一代测序 (NGS) 鉴定了先导结合剂L-18252。为了克服先导分子易聚集、纯度差的缺点，他们采用了定向进化 (directed evolution) 策略，包括位点饱和突变、组合突变和易错PCR，并创新性地整合了淀粉样聚集序列预测工具WALTZ作为筛选过滤器，同步优化结合亲和力与蛋白溶液行为。最后，他们将优化后的L-蛋白序列对应的D-蛋白（D-18252-evo）通过固相肽合成 (Fmoc SPPS) 和天然化学连接 (NCL) 化学合成出来，并通过生物层干涉技术 (BLI)、圆二色谱 (CD)、蛋白酶稳定性实验以及基于TF-1细胞的增殖与STAT6磷酸化检测等一系列生化与细胞功能实验进行了全面表征。
研究结果
2.1 靶向人白细胞介素-4的镜像设计方法
研究人员采用集成的计算与实验方法开发靶向IL-4的高亲和力D-蛋白结合剂。首先，他们通过计算反转天然L-IL-4结构中所有氨基酸的手性，生成了镜像D-IL-4分子。设计聚焦于D-IL-4上与天然L-IL-4的IL-4Rα结合区相对应的结构表位。利用RifGen模块基于该表位构建了旋转异构体相互作用场 (RIF)，并使用RifDock模块针对RIF筛选了一个包含五种不同拓扑结构的L-蛋白支架库，以识别潜在的D-IL-4结合剂。这些小型支架是之前通过片段组装等方法设计的具有稳定结构的迷你蛋白。随后通过酵母表面展示进行多轮高通量筛选，并结合定向进化来改善先导变体的结合亲和力与功能特性。最终，化学合成对应于最高亲和力L-蛋白序列的D-蛋白结合剂并进行功能验证。
2.2 L-和D-蛋白结合剂：设计、纯化与结合分析
研究人员化学合成了带有N端生物素标签的人白介素-4的D-对映体 (D-IL-4)，并证实其正确折叠。从设计流程中筛选出的7888个L-蛋白结合剂被构建成酵母展示文库。经过四轮使用浓度递减的D-IL-4进行的荧光激活细胞分选 (FACS) 和下一代测序 (NGS) 分析，L-18252被鉴定为富集程度最高的克隆。尽管纯化过程中发现L-18252有聚集倾向和宿主蛋白污染，但其与D-IL-4的结合解离常数 (KD) 仍达到220 ± 26 nM。对其关键界面残基的突变研究证实了这些残基对结合至关重要。化学合成的镜像分子D-18252与天然L-IL-4的结合亲和力 (KD= 2300 ± 270 nM) 显著弱于L-18252与D-IL-4的结合，表明L-18252欠佳的生物物理性质影响了其镜像对的结合强度。
2.3 L-18252–D-IL-4复合物的计算建模与界面分析
使用AlphaFold2预测的L-18252结构与设计模型高度一致，验证了设计方法的准确性。对Rosetta生成的复合物模型分析显示，L-18252的Phe34、Leu38和Leu42与D-IL-4的Ile29和Phe106之间形成广泛的疏水相互作用，同时界面还存在多个氢键和三个明确的盐桥，从结构上解释了观察到的结合亲和力与特异性。
2.4 L-18252的定向进化
为了同时提高结合亲和力和蛋白溶液行为，研究人员对L-18252构建了多位点突变库进行定向进化。关键创新在于将WALTZ聚集预测整合到进化循环中，用于早期淘汰易聚集的变体。由此获得的进化变体L-18252-evo含有11个突变，其纯化过程中的聚集和宿主蛋白污染显著减少，表现出更优的溶液行为和纯度。AlphaFold2结构预测表明这些突变未破坏蛋白的正确折叠。生物层干涉测量显示L-18252-evo与D-IL-4的亲和力提升至KD= 66 ± 9 nM。对其界面残基的突变再次证实了通过设计界面进行结合。
2.5 D-18252-evo的表征
化学合成L-18252-evo的镜像分子D-18252-evo。结合实验表明，D-18252-evo与天然L-IL-4以87 ± 13 nM的亲和力结合，与其L-对映体的性能相当。圆二色谱证实其具有正确的α-螺旋结构且谱图与L-对映体镜像对称。热变性实验显示D-18252-evo具有高热稳定性。蛋白酶稳定性实验证明，D-18252-evo在胰蛋白酶或胃蛋白酶中孵育20小时后仍保持完整，而其L-对映体在6小时内即被几乎完全降解，展现了D-蛋白卓越的抗蛋白酶降解能力。对L-IL-4界面残基的突变实验（如Arg105Glu/Phe106Glu）显著削弱了与D-18252-evo的结合，这与设计模型预测的结合模式一致。尺寸排阻色谱证实了D-18252-evo与L-IL-4可形成稳定的复合物。
2.6 D-18252-evo在细胞实验中的功能验证
在细胞实验中，D-18252-evo能有效抑制L-IL-4诱导的TF-1细胞增殖，半数抑制浓度 (IC50) 为370 nM。Western blot分析进一步证实，D-18252-evo能以剂量依赖的方式抑制L-IL-4诱导的STAT6磷酸化 (Tyr641)，其抑制效果与已知的IL-4结合抗体pascolizumab相当。这些结果证明，通过整合从头设计与定向进化方法开发出的靶向L-IL-4-受体界面的功能性D-蛋白抑制剂，能够有效阻断下游信号通路。
结论与意义
本研究的讨论部分强调了其在镜像蛋白工程领域的进展。与传统的、以随机筛选为基础的镜像噬菌体展示或单抗体平台相比，本研究建立了一种理性的、表位驱动的设计框架。该框架整合了从头计算设计与定向进化，并通过引入WALTZ聚集预测作为进化过滤器，实现了结合亲和力与蛋白溶液行为的同步优化，有效规避了以亲和力为中心的成熟策略中常见的聚集陷阱。
研究成功开发出了靶向人IL-4的镜像D-蛋白抑制剂D-18252-evo。经过定向进化优化后，该抑制剂具备约90 nM的结合亲和力、良好的热稳定性（在95°C下仍保持结构完整）以及强大的抗蛋白酶降解能力（胃蛋白酶处理20小时后仍完好）。这些特性凸显了D-蛋白在治疗IL-4介导疾病方面的治疗潜力。与传统的L-蛋白疗法相比，D-蛋白显著增强的体内稳定性为其在哮喘等慢性疾病的长期管理中提供了优势，其抗酶解特性甚至为开发口服蛋白类药物带来了新的可能。
该计算框架可适配于针对其他疾病相关靶点生成D-蛋白抑制剂。未来的工作重点应集中于优化D-18252-evo的递送策略和药代动力学性质，并在临床前动物模型中评估其疗效，以推动这种基于D-蛋白的IL-4信号调节剂向临床转化，为免疫介导性疾病开辟创新疗法。最后，研究明确指出，本研究仅限于作为治疗剂使用的、无细胞的化学合成D-蛋白，这些分子不含有核酸，也无任何复制能力，因此不存在产生自主“镜像生命”的风险，符合当前镜像分子生物学的生物安全准则。
