《Advanced Science》：Enzymatic Basis for the Oxidative Branch of Aromatic Amino Acid Fermentation Leading to p-cresol Formation
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本文针对严格厌氧菌（如艰难梭菌）在肠道中发酵酪氨酸产生毒性代谢物对甲酚的代谢途径尚不完全明确的问题，研究人员以产粪臭梭菌为模型，开展酪氨酸发酵氧化途径的酶学研究。结果鉴定并表征了将酪氨酸转化为对羟基苯乙酸的关键酶系（HpdDEFG/J/K），在体外重构了从对羟基苯丙酮酸到对甲酚的完整途径，并发现该途径广泛存在于梭菌纲厌氧菌中。该研究阐明了肠道细菌产生对甲酚等芳香族代谢物的关键机制，深化了对微生物-宿主代谢互作的理解。
在人体肠道这个复杂的生态系统中，居住着数以万亿计的微生物。其中，一些严格厌氧的细菌能够通过发酵我们摄入的蛋白质分解产物——氨基酸，来获取能量。这个过程会产生各种各样的代谢物，有些对人体有益，有些则可能带来麻烦。特别是芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）的发酵，会产生一系列结构多样的芳香族化合物。其中，对甲酚 就是一个备受关注的“麻烦制造者”。它主要由人类肠道病原体艰难梭菌 等细菌在发酵酪氨酸时产生。对甲酚不仅以其特殊的“畜棚”气味著称，更被证实具有毒性，能够抑制肠道内其他细菌的生长，可能导致菌群失调，并与心血管疾病、自闭症等人类疾病相关联。尽管已知对甲酚生成的最后一步是由一种对氧气极其敏感的糖基自由基酶——对羟基苯乙酸脱羧酶 催化的，但对于酪氨酸如何一步步转化为其前体对羟基苯乙酸 的完整氧化代谢途径，其具体的酶学基础几十年来一直是个未解之谜。为了解决这个关键问题，阐明肠道细菌产生这类重要芳香族代谢物的完整生化蓝图，研究人员在产粪臭梭菌——一个已知高产对甲酚和粪臭素的模式细菌中，展开了深入探索。这项研究成果最终发表在《Advanced Science》 期刊上。
为了开展这项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术方法：1. 生物信息学分析与基因簇鉴定：通过分析产粪臭梭菌等细菌的基因组，锁定可能与对甲酚生成相关的候选基因簇。2. 体外酶学重建与动力学分析：将预测的基因进行重组表达、纯化蛋白质，在严格厌氧条件下重建生化反应途径，并使用分光光度法、液相色谱-质谱联用 和气相色谱-质谱联用 等技术，系统测定各酶（HpdDEFG, HpdJ, HpdK, HPAD）的活性、底物特异性及动力学参数。3. 细菌培养与代谢物分析：在含酪氨酸的培养基中培养产粪臭梭菌，监测其生长、相关基因的转录水平变化，并利用实时荧光定量PCR 和LC-MS/GC-MS 动态追踪酪氨酸、对羟基苯乙酸和对甲酚的代谢变化。4. 蛋白结构与复合物建模：利用AlphaFold 和AlphaFold3 对关键酶复合物的结构进行预测和建模。
研究结果
2.1 产粪臭梭菌中对甲酚形成相关基因簇
研究人员在产粪臭梭菌基因组中对羟基苯乙酸脱羧酶基因附近，发现了一个包含多个基因的簇。其中，HpdDEFG 与丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶 同源，HpdJ 和HpdK 分别与磷酸丁酰转移酶 和丁酸激酶 同源。由此提出了一个从对羟基苯丙酮酸 经氧化、磷酸化最终生成对羟基苯乙酸 和ATP的假设途径。
2.2 HpdDEFG的表征：一种HPP-Fdx氧化还原酶
HpdDEFG被成功表达、纯化并在厌氧条件下重建了其[Fe-S]簇。活性实验证明，该酶能以对羟基苯丙酮酸 为最佳底物，在辅酶A存在下，将其氧化为对羟基苯乙酰辅酶A，同时还原铁氧还蛋白或人工电子受体苄基紫精。动力学分析显示其对HPP具有高催化效率。
2.3 HpdJ的表征：一种磷酸HPA-转移酶
纯化的HpdJ能够催化对羟基苯乙酰辅酶A 的磷酸解，释放出辅酶A，生成对羟基苯乙酰磷酸。该酶对HPA-CoA和苯乙酰辅酶A均显示活性。
2.4 HpdK的表征：一种HPA-激酶
纯化的HpdK能够以ATP为磷酸供体，将对羟基苯乙酸 磷酸化生成对羟基苯乙酰磷酸 和ADP（实验中检测的是逆反应方向）。该酶对HPA具有高度特异性。
2.5 HPP转化为对甲酚途径的体外重建
将HpdDEFG、HpdJ和HpdK三种酶与底物、辅因子在厌氧条件下共同孵育，成功从对羟基苯丙酮酸 生成了对羟基苯乙酸。当加入预先激活的HPAD后，进一步检测到了终产物对甲酚 的生成，从而在试管中完整重现了从HPP到对甲酚的生化途径。
2.6 产粪臭梭菌在含酪氨酸培养基中的生长
在添加酪氨酸的培养基中，产粪臭梭菌的生长密度增加，并且HpdJ, HpdE, HpdK, HpdB等途径基因的转录水平显著上调。培养上清中可检测到对羟基苯乙酸 和对甲酚 的积累，且HPA先积累后减少，而对甲酚的产生存在滞后，这与途径中HPA作为HPAD底物的顺序相符。
2.7 梭菌纲中PFOR同源物的序列多样性
通过生物信息学分析发现，在梭菌纲细菌中，与HpdE同属PFOR家族 的酶可根据序列相似性分为多个功能簇。HpdE与已知的2-酮异戊酸氧化还原酶 归为一簇，而非与芳基丙酮酸氧化还原酶同簇。这些氧化还原酶基因附近常伴随磷酸酰基转移酶/酰基激酶或ADP形成型酰基辅酶A连接酶 的基因，提示存在不同的酰基辅酶A代谢路径。
2.8 艰难梭菌中相关激酶和连接酶的活性测定
对艰难梭菌中与不同PFOR同源物基因簇相关的激酶和连接酶进行底物特异性测试，发现其活性谱与它们所在的基因簇预测的代谢功能一致。例如，与预测的VOR（酮异戊酸氧化还原酶）相关的激酶对丙酸、异丁酸和异戊酸活性最高；而与预测的芳基丙酮酸代谢相关的酶则对苯乙酸和对羟基苯乙酸显示较高活性。
研究结论与意义
本研究成功在产粪臭梭菌中鉴定并完整表征了一条将酪氨酸转化为对羟基苯乙酸 的氧化代谢途径。该途径由三种酶HpdDEFG、HpdJ 和HpdK 依次催化，每一步在热力学上均可逆，并耦联产生ATP和还原型铁氧还蛋白，为细菌生长提供能量。这实质上是芳香族氨基酸在氧化型斯特克兰途径 中的代谢方式，类似于丙氨酸发酵的经典途径。体外实验成功重建了从对羟基苯丙酮酸 到对甲酚 的完整反应链。体内实验证实，在酪氨酸存在下，产粪臭梭菌激活该途径基因并依次产生HPA和对甲酚。
研究发现，HpdDEFG在进化上更接近酮异戊酸氧化还原酶，却对芳基丙酮酸具有高度特异性，这揭示了PFOR家族酶功能多样性的一个新例。生物信息学分析表明，包含类似三重酶（氧化还原酶、转移酶、激酶）的基因簇在厌氧的厚壁菌门细菌中广泛存在，提示类似的途径可能也用于其他氨基酸的降解。
这项研究具有重要意义：首先，它首次阐明了严格厌氧菌发酵酪氨酸产生对羟基苯乙酸 这一关键前体的完整酶学机制，填补了该领域数十年的知识空白。其次，它揭示了肠道细菌产生对甲酚 这一重要毒性及信号分子的完整生化蓝图，加深了对肠道微生物群落代谢互作及其如何影响宿主健康（如菌群失调、疾病发生）的理解。最后，通过生物信息学拓展，该研究为在更广泛的微生物组中预测和解析芳香族氨基酸代谢途径提供了基因标志和理论框架，有助于未来开发针对相关代谢产物的干预策略。
