《Cancer Discovery》：Acquired On-Target Alterations Drive Clinical Resistance to p53-Y220C Reactivators
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针对p53-Y220C突变癌症的小分子再激活剂Rezatapopt展现出临床潜力，但获得性耐药是其主要挑战。本研究通过对治疗进展患者进行ctDNA、肿瘤活检和快速尸检样本分析，首次揭示了临床耐药机制：肿瘤细胞通过在原Y220C突变基础上产生大量异质性的二次TP53突变实现逃逸。这些突变分为两类：一类是导致p53功能失活的DNA结合域突变或移码/无义突变；另一类位于Y220C药物结合裂隙，干扰药物结合。功能实验证实了这些双重突变可消除Rezatapopt的再激活作用。该研究为p53 Y220C再激活剂的耐药机制提供了分子框架，并指导开发克服耐药的下一代药物。
被誉为“基因守护者”的TP53（p53蛋白编码基因）是人体最重要的肿瘤抑制基因之一，其功能的丧失是癌症发生中最常见的事件。然而，长期以来，如何用小分子药物精准修复突变失活的p53蛋白，使其恢复抑癌功能，一直是肿瘤靶向治疗领域难以逾越的高峰。直到研究者发现，某些特定突变位点（如Y220C，即第220位酪氨酸突变为半胱氨酸）意外地在突变蛋白上创造出一个天然野生型蛋白所没有的、可被小分子药物结合的“隐秘口袋”，这为“复活”突变p53带来了希望。Rezatapopt（代号PC14586）正是基于此设计的首个进入临床的、口服生物可利用的p53-Y220C再激活剂。在PYNNACLE I/II期临床试验中，它对多种实体瘤展现出34%的客观缓解率和7.6个月的中位缓解持续时间，前景令人鼓舞。但与其他靶向疗法一样，获得性耐药最终出现。患者为何会产生耐药？其背后的分子机制是什么？这成为决定此类疗法成败和未来发展的关键问题。近日，一项发表在《Cancer Discovery》杂志上的研究，首次从临床层面揭开了p53-Y220C再激活剂获得性耐药的神秘面纱。
为了探索临床耐药机制，研究人员对PYNNACLE试验中接受Rezatapopt单药治疗后病情进展的两位晚期实体瘤患者进行了深入分析。他们主要运用了循环肿瘤DNA（ctDNA）测序、肿瘤组织全外显子组测序（WES）以及对快速尸检标本的基因组分析。通过追踪治疗过程中ctDNA的动态变化，结合对进展期肿瘤组织的深度测序，并利用细胞模型对发现的突变进行功能验证，系统性地阐明了耐药的分子基础。
结果
两位患者均出现大量异质性获得性TP53突变
患者1是一位58岁女性，患有低分化HPV阴性头颈癌。在接受Rezatapopt治疗并获得持续约5个月的影像学部分缓解后，病情出现进展。对进展期样本的分析显示，出现了多达94个TP53突变，绝大多数在ctDNA中检测到。患者2是一位65岁男性，患有转移性输尿管鳞状细胞癌。他对Rezatapopt治疗有临床获益，疾病稳定约6个月后出现新发肝转移。进展后的ctDNA分析及快速尸检组织测序揭示了13个治疗前未检测到的TP53新突变。对患者2的系列ctDNA样本进行液滴数字PCR（ddPCR）分析发现，Y220C TP53的等位基因频率在治疗初期下降，但在肿瘤进展时急剧反弹，且反弹伴随着一系列新TP53突变的出现。
获得性突变可分为两类
这些新出现的突变可归为两类：第一类突变会损害p53功能，包括作为“二次打击”使被药物恢复的p53再次失活的DNA结合域点突变，以及导致产生无功能蛋白的移码或无义突变。第二类突变发生在Y220C结合裂隙内部，可能通过改变裂隙结构来阻碍药物结合。
功能模型证实获得性突变驱动耐药
研究者在p53缺失的非小细胞肺癌（NSCLC）和头颈鳞状细胞癌细胞模型中，引入了从两类突变中选取的代表性突变，使其与原Y220C突变顺式表达。结果表明，与仅表达Y220C单突变的细胞相比，表达双重突变的细胞对Rezatapopt的敏感性完全丧失，半数抑制浓度（IC50）增加了十倍以上。在Y220C单突变细胞中，Rezatapopt能重新激活p53，并诱导p53靶基因（如细胞周期抑制剂p21、p53负调控因子MDM2、促凋亡基因PUMA）的表达上调。但在表达双重突变的细胞中，Rezatapopt处理无法引起这些靶基因的上调。这些结果证实，这些在原Y220C基础上获得的二次突变是导致耐药的原因。
两类耐药突变的具体机制
第一类获得性突变（如R175H, R248W, R273C, R282W）是已知的p53失活性点突变，它们位于Y220C裂隙之外，但位于对p53发挥转录因子功能至关重要的DNA结合域。因此，即使Rezatapopt能结合并恢复p53构象，这些突变仍能使p53失活。这类“二次打击”突变可能导致对所有通过结合Y220C裂隙来恢复p53功能的小分子药物产生普遍耐药。
第二类突变（如F109, L145, V147, P151, P152位点的突变）则直接位于Rezatapopt的结合口袋内。其中一部分突变（如V147L）本身并不损害p53功能，p53-V147L蛋白仍能结合染色质、结合靶基因启动子并激活下游基因转录，与野生型p53功能相似。因此，这类突变很可能是通过改变Y220C裂隙的结构，降低Rezatapopt的结合亲和力，从而导致耐药，这可能是药物特异性的。而另一部分位于结合裂隙内的突变（如P152R）则同时部分损害了p53的转录活性。
结论与讨论
本研究首次提供了临床证据，表明在原靶点TP53上产生二次突变，是p53-Y220C再激活剂Rezatapopt产生获得性耐药的主要机制。尽管分析仅基于两名患者，但两人均在复发时出现了大量新生的TP53突变，强烈提示Y220C靶向治疗的选择压力塑造了肿瘤的进化。其中一名患者甚至出现了近百个新TP53变异，这种罕见的基因组多样化程度，凸显了肿瘤为了消除p53功能、逃避药物诱导的细胞死亡所具有的强大进化驱动力。
通过功能表征，研究确立了至少两种机制类别的耐药。第一类包括破坏性的TP53突变（如DNA结合域点突变、移码/无义突变），它们消除了p53的转录活性，预计会导致对该治疗类别内所有药物的交叉耐药。第二类包括聚集在Y220C结合表面的突变，它们可能通过重塑药物结合的裂隙结构来干扰Rezatapopt的结合。重要的是，第二类中的部分突变（如V147L）并不必然废除p53活性，这表明此类耐药可能是药物特异性的，而非对所有Y220C再激活剂都适用。
这些发现具有直接的转化意义。结构生物学见解表明，如果某些耐药突变选择性地损害Rezatapopt结合而不破坏突变蛋白的稳定性，那么具有不同空间结构、更高结合亲和力或不可逆共价化学性质的替代化合物可能仍保持疗效。理性的、基于结构的药物设计对于开发能够规避此类耐药的下一代Y220C再激活剂至关重要。相比之下，那些导致p53功能完全丧失的二次突变则构成了更大的治疗挑战。克服这类耐药可能需要将p53再激活剂与靶向p53缺失所引发脆弱性（如DNA损伤反应或细胞周期调控依赖性）的药物联合使用。
总之，这项研究为理解p53等位基因特异性再激活这一新兴领域的治疗耐药性建立了分子框架。未来需要在更大的患者队列中开展研究，以确定这些耐药类别的流行率、出现时间和进化动力学。整合功能实验与患者基因组数据，对于区分普遍性的p53失活突变和药物特异性的逃逸突变至关重要，这将为临床决策和下一代药
