《Nature Biotechnology》：Mirror-enhanced 4Pi-SMLM with one objective enables isotropic nanoscale imaging
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传统双物镜4Pi单分子定位显微术(4Pi-SMLM)虽能提供各向同性的纳米级分辨率，但其复杂的仪器和苛刻的对准要求限制了广泛应用。为解决此难题，研究人员研发了“镜面增强型4Pi-SMLM”(me4Pi-SMLM)。这项新技术采用单物镜配置，利用镜面后向反射照明光束来产生相位可调的干涉条纹，将基于像散的轴向分辨率提升了约五倍，性能媲美常规4Pi-SMLM，同时极大地降低了系统复杂性和维护成本。me4Pi-SMLM在生物样本中实现了2-3 nm的近各向同性定位精度，能够清晰分辨多种超微结构，并完成了亚15 nm的各向同性分辨率脑片成像、高保真双色成像、纳米级全细胞重建和活细胞成像。其重要意义在于能够轻松集成到现有3D-SMLM系统中，以最小成本和努力显著提升性能，为分子尺度的细胞结构与动力学研究提供了强大、易用的新工具。
在探索生命奥秘的征途上，科学家们渴望能有一双“慧眼”，看清细胞内分子水平的精细构造。荧光显微技术的巨大进步，特别是单分子定位显微术(SMLM)的出现，让我们得以窥见亚细胞超微结构和天然蛋白质复合体的细节。然而，传统三维SMLM存在一个明显的短板：其轴向分辨率通常比横向分辨率差两到三倍，这种各向异性的分辨率限制了我们获得真实、均衡的三维图像。为了解决这个问题，干涉测量方法如4Pi-SMLM应运而生。它通过双物镜相干检测，将轴向定位精度提高了约五倍，实现了整个细胞内多色成像的10-15 nm各向同性三维分辨率。尽管如此，4Pi-SMLM复杂的仪器、严苛的对准要求和高昂成本，如同高耸的门槛，将其应用限制在全球少数专业实验室中。尽管像ROSE-Z这样的技术尝试用单物镜和激发光干涉来简化架构，但它仍然依赖于延伸光路间的双光束干涉，本质上易受热波动、机械振动和漂移引起的相位不稳定性影响。这些持续存在的挑战，突显了生物学常规成像对一种更易用、更稳健、更用户友好的干涉测量方案的迫切需求。
正是在这样的背景下，一项发表于《Nature Biotechnology》的研究带来了突破。研究人员受到基于镜面的激发或发射干涉策略启发，开发了“镜面增强型4Pi-SMLM”(me4Pi-SMLM)。这是一种简化的单物镜配置，其性能与ROSE-Z相当，并可媲美双物镜4Pi-SMLM，同时极大地降低了复杂性、维护需求和成本。研究表明，me4Pi-SMLM在生物样本中实现了2-3 nm的近各向同性定位精度，清晰地解析了微管束的空心结构、核孔复合体内不同的亚基以及内质网的片状形态等精细超微结构特征。该方法进一步实现了多样本中的同步双色成像和全细胞重建，以及高时空分辨率的三维活细胞成像和单分子追踪。此外，它还在脑组织切片中实现了亚15 nm的各向同性分辨率。这些能力共同彰显了me4Pi-SMLM在分子尺度上阐明细胞结构和动力学的巨大潜力。
为开展此项研究，作者主要采用了以下几项关键技术方法：首先，自主搭建了me4Pi-SMLM光学系统，其核心是利用单个物镜，并通过样本上方的一个保护性银镜后向反射照明光束，直接产生轴向驻波干涉图案，一个压电致动器可快速平移该镜以获取相位偏移图像。其次，采用了DNA点积累纳米拓扑成像(DNA-PAINT)技术以及纳米抗体替代传统抗体对进行标记，以优化成像性能并减小标记尺寸。再次，建立了me4Pi-SMLM图像处理和三维定位算法流程，包括基于像散的二维高斯拟合进行粗定位，以及通过分析子图像强度提取相位和调制深度，再结合脊寻找算法进行相位解包裹以获得精确的轴向位置。此外，研究还整合了“挽救荧光”方法以实现同步双色成像，并开发了快速成像模式以适应dSTORM等应用。在样本方面，研究使用了多种细胞系（如COS-7、U-2 OS、HeLa）的固定和活细胞样本，以及来自C57BL/6J、Rosa26-GFP-OMP25和ChAT-Cre-ChR2-YFP转基因小鼠的脑组织切片和精母细胞样本。
结果
me4Pi-SMLM的实现与表征
me4Pi-SMLM的基本原理是通过单物镜和镜面后向反射来产生干涉条纹，从而绕过了昂贵的物镜配对和复杂的双物镜对准需求。通过压电致动器快速平移镜面，以亚纳米精度移动干涉图案，从而顺序采集三幅相位偏移图像。为了消除相位周期性模糊，引入了圆柱透镜产生轻微像散，实现粗轴向定位和可靠的相位解包裹。这种架构简化了机械设计、光电子同步、光学对准和图像处理。研究人员实施了me4Pi-SMLM定位流程，顺序地在单个相机区域采集三幅相位偏移图像，消除了通道配准的需要。通过对40 nm荧光珠成像进行表征，me4Pi-SMLM在光子数约5300的条件下，与传统3D-SMLM相比，轴向定位精度提高了约五倍，在所有维度上达到了2-3 nm的定位精度。
me4Pi-SMLM解析亚细胞结构
在生物样本评估中，采用DNA-PAINT和纳米抗体标记。对COS-7细胞微管成像显示，me4Pi-SMLM增强的轴向分辨率比3D-SMLM更有效地解析了单个和成束微管的环状结构。对发射十帧或更多帧的分子进行分析，在光子数约5500的条件下，me4Pi-SMLM在细胞内实现了2-3 nm的定位精度。对U-2 OS细胞内核孔复合体成像显示，me4Pi-SMLM比3D-SMLM更清晰地解析了核质环和细胞质环。通过对500个NPC进行颗粒平均，me4Pi-SMLM可视化出近全部32个Nup96拷贝，在结构平均中分辨了相邻10 nm横向间隔和3 nm轴向间隔的两个Nup96蛋白，证明了其优于10 nm的三维分辨率。对内质网成像显示，me4Pi-SMLM揭示了内质网是由中空管（直径60-100 nm）和片状结构连接的网络，高轴向分辨率使其能够清晰可视化厚度为30-50 nm的片状结构。
同步双色me4Pi-SMLM成像
研究人员将已建立的挽救荧光方法与me4Pi-SMLM整合，实现了同步双色成像。确定了Alexa Fluor 568和ATTO Rho11作为与Cy3B在552 nm激发下光谱兼容的染料对。在COS-7细胞中共标记微管和内质网，me4Pi-SMLM实现了稳健的光谱分离和最小的串扰，在横向和轴向上解析了内质网管和微管的空心中心。进一步通过标记内质网外膜和腔内，高分辨率有效区分了这些紧密相邻的区室并解析了不同的内质网亚结构。
me4Pi-SMLM全细胞成像
me4Pi-SMLM通过圆柱透镜引入像散来克服轴向模糊，实现了厚样本内的高分辨率成像。对于超过景深（约1.2 μm）的成像体积，需要进行轴向样本扫描。通过对小鼠精母细胞核中联会复合体进行成像，me4Pi-SMLM在整个细胞核中解析了完全联会的染色体，清晰地揭示了联会复合体亚结构的特征性双螺旋结构。通过对HeLa细胞线粒体外膜进行深度达4.5 μm的成像，从七个光学切片重建体积，清晰地解析了膜轮廓和复杂的互连，没有可检测的伪影。定量分析证实，me4Pi-SMLM在整个成像体积中保持了3-5 nm的高DAFL定位精度和10-15 nm的FRC分辨率。
高速采集模式下的me4Pi-SMLM成像
me4Pi-SMLM的主要限制是要求分子在三幅连续的相位图像中保持荧光，这需要相对较长的“开启”时间。为了解决这一限制，研究人员实现了使用重新编程同步的快速成像模式。通过使用荧光DNA-PAINT探针对固定COS-7细胞的微管进行成像验证，循环时间为9 ms，比慢速成像模式快五倍，获得了约8 nm的FRC分辨率，解析的微管空心中心图像质量与慢速模式相当。这种提高的采集速度使得该方法适用于dSTORM应用。演示中，使用与Alexa Fluor 647偶联的抗体对固定COS-7细胞中的线粒体进行成像，循环时间为15 ms，所得图像高保真地解析了线粒体的膜轮廓和互连。
活细胞中的me4Pi-SMLM成像
迄今为止，传统的4Pi-SMLM方法尚未能实现活细胞成像，这源于其系统复杂性高、加剧机械和热漂移、降低荧光收集效率以及与标准样本载具不兼容等多个技术挑战。相比之下，me4Pi-SMLM光学复杂性降低、稳定性提高、光子效率增强且与共聚焦培养皿兼容，因此具有活细胞成像应用的潜力。作为概念验证，研究人员生成了稳定表达Sec61β-Emerald-HaloTag的U-2 OS细胞系，并用活细胞兼容染料PA-JF549-HaloTag进行标记。在共聚焦培养皿中用me4Pi-SMLM以9 ms循环时间对活细胞成像，在10分钟内捕获了内质网动力学。在10秒的时间分辨率下，重建结果揭示了细胞外周内质网管状网络的动态。此外，研究人员将me4Pi-SMLM应用于三维单分子追踪。通过结合降低浓度的PA-JF549-HaloTag和脉冲激活，在30秒内累计轨迹有效地重建了内质网管状网络，而单个三维轨迹揭示了异质的分子运动性。 Notably，研究人员在每个方向上实现了约6-7 nm的定位精度，从而能够在纳米尺度上定量分析多样的分子行为。
脑切片中的me4Pi-SMLM成像
与依赖于双物镜相干干涉的传统4Pi-SMLM相比，me4Pi-SMLM采用与单物镜3D-SMLM显微镜等效的检测配置，使其本质上更兼容组织成像。首先，研究人员在30 μm厚的小鼠脑切片中的多个深度对线粒体成像。在整个组织体积中，观察到线粒体的不同形态。值得注意的是，这些线粒体结构与培养细胞中通常观察到的延伸管状网络明显不同。定量分析证实，获得了约6 nm的DAFL三维精度和约12 nm的FRC分辨率，两者均保持至约20 μm的成像深度。接下来，研究人员检查了光敏感离子通道通道视紫红质2(ChR2)的纳米级组织。对30 μm脑切片成像揭示了沿轴突分布的离散的、膜相关的ChR2簇。这些组装体在整个轴突膜上表现为中空的管状特征和斑点状结构。凭借约6 nm的DAFL三维精度和亚15 nm的FRC分辨率，研究人员重建了ChR2的三维分子组织。这种在组织切片内解析分子水平细节的能力，弥合了超微结构与生理功能之间的鸿沟。
结论与讨论
研究人员开发了me4Pi-SMLM，这是一种用于3D-SMLM的简单解决方案，在考虑生物样本中标记尺寸的情况下，实现了三个维度上亚10 nm的分辨率。me4Pi-SMLM提供了与ROSE-Z相当、可与传统4Pi-SMLM比拟的性能，同时极大地降低了硬件复杂性和对准工作量。 Notably，几乎任何现有的3D-SMLM系统都可以通过简单地添加一个镜子和一个价格合理的压电致动器升级到me4Pi-SMLM。这与需要大量专业知识和巨额资金投入的传统4Pi-SMLM形成鲜明对比。在快速成像模式下，me4Pi-SMLM的采集速度最终受相机读出和压电致动器步进稳定时间的限制。使用更快的压电致动器结合共振镜或电光调制器，将相位图像快速投影到单独的相机区域，可以实现更短的曝光时间，并拓宽与更广泛生物学应用的兼容性。此外，基于深度学习的方法已实现了密集单分子定位，为提高me4Pi-SMLM在活细胞成像中的时间分辨率提供了潜力。本研究中，组织成像深度限于约20 μm作为概念验证。超过此深度，样本引起的光学像差会显著降低图像质量。然而，3D-SMLM的最新进展已证明使用复杂算法和自适应光学可以有效校正此类像差。将这些方法整合到me4Pi-SMLM中可将成像深度扩展到约50 μm。从历史上看，SMLM是使用宽场照明发展起来的，而MINFLUX开创了使用图案化照明来提高定位精度。虽然类MINFLUX技术因其依赖单环形照明而固有地受限通量，但随后使用条纹图案的并行化策略被用来提高横向或轴向分辨率，尽管分辨率增益有所降低。本研究中，me4Pi-SMLM仅使用轴向照明干涉来实现卓越的轴向定位，但可以无缝地与横向照明干涉结合，以增强所有维度的分辨率。该策略有两个关键优势：所有维度上的分子定位直接由分子光子发射相对于照明图案决定，而不是由PSF图案决定，这使其天生抗光学像差；并且由于定位由照明波长定义，因此在多色成像中消除了色差。结合能够最小化探针尺寸和提高效率的先进标记策略，me4Pi-SMLM能够在多样化的生物学背景中实现多重、分子尺度的成像。
