《Human Genetics》：??Integrating machine learning and spatial transcriptomics uncovers shared immunomodulatory deubiquitinases in MAFLD and HCC
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针对肝细胞癌（HCC）早期筛查难、预后评估不精准及免疫治疗响应预测缺乏有效标志物的问题，研究人员整合机器学习与空间转录组学技术，筛选MAFLD与HCC共有去泛素化酶（DUBs），构建去泛素化评分（DUBS）。结果显示低DUBS患者生存获益显著且对免疫治疗更敏感，核心基因EIF3F具跨疾病诊断价值，为HCC精准诊疗提供新靶点与工具。
在全球癌症版图中，肝细胞癌（HCC）堪称“沉默的杀手”——它位列全球恶性肿瘤发病率第七位、癌症相关死亡率第三位，每年新增病例约占所有恶性肿瘤的5%。更棘手的是，HCC起病隐匿，早期缺乏特异性症状，约60%的患者确诊时已处于中晚期，错失了根治性治疗的最佳时机。尽管近年来靶向联合免疫治疗的突破改写了HCC的治疗格局，但仍有30%-40%的患者对一线治疗方案原发性耐药，整体预后依然不容乐观。
这一困境的背后，代谢功能障碍相关脂肪肝病（MAFLD）的角色不容忽视。流行病学数据显示，MAFLD已成为驱动HCC发病率持续上升的首要因素，约48.7%的HCC病例与MAFLD相关。但与病毒性肝炎等独立致癌因素不同，MAFLD更多扮演“共病助推器”的角色——仅12.4%的HCC以MAFLD为唯一病因。这种复杂的共病关系提示，单纯针对单一疾病的诊疗策略难以应对HCC的高度异质性，亟需从分子层面解析MAFLD与HCC的共享调控网络，为早期筛查、预后评估和精准治疗提供新思路。
在此背景下，去泛素化酶（DUBs）进入了研究者的视野。作为蛋白质稳态的关键调控者，DUBs通过水解底物上的泛素链，逆转泛素化修饰的生物学效应，广泛参与脂代谢重编程、炎症微环境重塑等关键病理过程。已有研究证实，RPN11、USP家族成员等DUBs在MAFLD的脂质代谢紊乱和HCC的细胞增殖、干性维持中发挥重要作用，但尚未发现同时调控两种疾病进展的“双功能”DUBs分子。能否通过多组学整合分析，锁定MAFLD-HCC共病过程中的核心DUBs调控节点，并基于此构建具有临床转化价值的预后评估体系？这正是本研究试图回答的核心问题。
为解答上述问题，研究团队开展了一项整合多组学分析与实验验证的系统研究。他们首先从公共数据库获取MAFLD和HCC的基因表达矩阵及临床信息，通过差异表达分析和12种机器学习算法组合筛选共有DUBs；随后基于TCGA-LIHC、LIRI-JP和GSE116174三个独立HCC队列，构建由4个核心DUBs组成的去泛素化评分（DUBS）系统；并通过多维度肿瘤微环境分析、药物敏感性预测、单细胞及空间转录组学解析，结合体外细胞实验和体内动物模型验证，全面阐释DUBS的临床价值及核心基因EIF3F的致癌机制。
在技术方法层面，研究主要依托以下关键技术：一是多队列数据整合分析，涵盖GEO、TCGA、ICGC等数据库的MAFLD和HCC转录组数据，以及两个抗PD-1/PD-L1治疗的黑色素瘤队列用于免疫治疗响应验证；二是机器学习模型构建，采用Lasso、随机森林等12种算法筛选特征基因，通过10折交叉验证优化模型性能；三是多维度肿瘤微环境评估，整合TIDE（肿瘤免疫功能障碍与排斥）、IPS（免疫表型评分）、ESTIMATE等算法量化免疫细胞浸润、基质评分及免疫检查点表达；四是药物敏感性分析，基于GDSC（癌症药物敏感性基因组学）和CTRP（癌症治疗反应门户）数据库预测化疗药物响应，并通过分子对接模拟核心蛋白与小分子药物的相互作用；五是单细胞RNA测序与空间转录组学分析，利用Seurat、CellChat等工具解析肿瘤微环境的细胞组成及空间分布特征；六是体外功能实验（包括Western Blot、伤口愈合、Transwell、CCK-8、克隆形成实验）和体内裸鼠皮下移植瘤模型，验证核心基因EIF3F对HCC恶性表型的调控作用。
研究结果部分，各模块结论如下：
Shared gene identification in MAFLD and HCC：通过TCGA-LIHC和GSE135251队列的交叉差异分析，筛选出31个MAFLD与HCC共有的差异表达DUBs；经12种机器学习算法比较，Lasso+LDA组合模型表现最优（训练集和验证集AUC均>0.7），最终锁定15个具有关键调控潜力的DUBs，其中多数在癌组织中呈上调趋势。
Establishment of DUBS：对15个DUBs进行单变量Cox回归分析，筛选出10个与HCC预后显著相关的分子；进一步通过多变量Cox比例风险模型，构建包含USP39、USP32、OTUB2和EIF3F的DUBS系统，计算公式为DUBS = Exp(USP39)×0.069 + Exp(USP32)×0.075 + Exp(OTUB2)×0.238 + Exp(EIF3F)×0.014。SHAP（沙普利加性解释）分析证实核心基因表达与预后预测效能正相关；在TCGA-LIHC、ICGC和GSE116174三个独立队列中，低DUBS组患者总生存期均显著延长。通路富集显示，高DUBS组细胞周期调控、DNA复制等增殖相关通路过度激活，低DUBS组脂质代谢、氧化磷酸化等代谢通路持续活跃。
Analysis of DUBS prognostic model’s diagnostic value across diseases and clinical translation：单变量和多变量Cox回归均证实DUBS是HCC的独立预后危险因素，高DUBS与肿瘤恶性程度正相关。诊断价值分析显示，USP39（AUC=0.965）、EIF3F（AUC=0.887）、OTUB2（AUC=0.930）在HCC鉴别诊断中表现优异；OTUB2（AUC=0.870）、USP32（AUC=0.761）、EIF3F（AUC=0.731）在早期MAFLD识别中具高诊断效能，其中OTUB2和EIF3F是跨两种疾病的关键诊断标志物。基于DUBS构建的列线图模型整合了分子标志物与临床特征，为个体化预后管理提供了量化工具。
Analysis of hot tumor phenotype reveals mechanisms underlying immunotherapy sensitization in low-DUBS group patients：在两个独立的抗PD-1/PD-L1治疗队列中，低DUBS患者总生存期和无进展生存期均显著更长，且完全缓解/部分缓解（CR/PR）亚组DUBS评分低于疾病稳定/进展（SD/PD）亚组。TIDE分析显示低DUBS组免疫逃逸预测值更低，MSI（微卫星不稳定性）水平显著升高；基于Thorsson免疫分类，C3亚型（Th17/Th1特征主导）患者预后优于C1亚型（血管生成特征主导）。IPS分析证实，无论靶向PD-1还是CTLA4，低DUBS组均表现出更强的治疗敏感性。肿瘤微环境评估显示，低DUBS组基质评分、免疫评分及综合评估值均显著升高，呈现典型的“热肿瘤”表型——免疫细胞浸润丰富、微环境活跃。
Clinical application value of DUBS core genes in drug sensitivity prediction and combination therapy for HCC：药物敏感性分析显示，甲氨蝶呤、伏立诺他、tubastatin A的响应与OTUB2表达正相关，与EIF3F表达负相关；阿西替尼、多柔比星、依托泊苷、丝裂霉素、长春新碱的敏感性也与OTUB2表达正相关。DUBS分组模型中，5-氟尿嘧啶、阿法替尼、吉非替尼、厄洛替尼、达沙替尼、环磷酰胺在低DUBS组疗效更优，顺铂、吉西他滨、阿西替尼、伊立替康在高DUBS组响应更佳。分子对接模拟显示，索拉非尼、多纳非尼、多柔比星、瑞戈非尼、仑伐替尼、吉西他滨均可与EIF3F蛋白结合，其中索拉非尼因高结合亲和力和HepG2细胞低IC50值，可能通过靶向EIF3F发挥选择性抗HCC作用。
Spatial transcriptomics elucidates EIF3F associated microenvironmental heterogeneity as a determinant of combination therapy outcomes in HCC：单细胞转录组图谱显示HCC包含13个细胞亚群，分属5大类细胞类型，EIF3F在大多数细胞谱系中表达显著升高，这一泛细胞分布模式经空间转录组验证。细胞间通讯网络分析发现NK细胞信号活性最强，CD74-CXCR4分子对为核心信号枢纽。空间转录组原位分析显示，靶向-免疫联合治疗敏感组EIF3F表达较低，耐药组则显著富集，提示EIF3F可调控治疗敏感性。
Pan-cancer expression-prognosis associations and immunotherapy response prediction of DUBS core genes：泛癌分析显示，OTUB2、USP32、USP39在大多数癌症类型中上调，EIF3F在CHOL（胆管癌）、COAD（结肠癌）、GBM（胶质母细胞瘤）、KIRC（肾透明细胞癌）、KIRP（肾乳头状细胞癌）、LIHC（肝细胞癌）、PRAD（前列腺癌）、READ（直肠癌）、THCA（甲状腺癌）中特异性高表达。生存分析表明，高EIF3F表达与ACC（肾上腺皮质癌）、LIHC、PCPG（嗜铬细胞瘤和副神经节瘤）不良预后相关；OTUB2是CESC（宫颈癌）、LIHC、MESO（间皮瘤）、PCPG、SARC（肉瘤）的风险因素；USP32提示KICH（肾嫌色细胞癌）、KIRP、LIHC、PCPG、UCEC（子宫内膜癌）预后较差；USP39在ACC、KICH、KIRC、KIRP、LAML（急性髓系白血病）、LGG（脑低级别胶质瘤）、LIHC、MESO、PAAD（胰腺导管腺癌）、PCPG、UCEC等11种癌症中与风险显著相关。免疫治疗响应预测显示，BLCA（膀胱癌）、BRCA（乳腺癌）、HNSC（头颈部鳞状细胞癌）、KIRC、PRAD、THCA的高DUBS组更敏感，而GBM、LGG、LUAD（肺腺癌）、SARC的低DUBS组响应更佳。
Validation of EIF3F expression：Western Blot检测显示，EIF3F在HCC细胞系Huh7、HepG2中表达显著高于肝星状细胞LX-2，在C3A细胞中表达较低，因此选择Huh7和HepG2进行后续功能研究。
Effects and mechanisms of EIF3F gene knockdown on malignant phenotypes in HCC：通过shRNA构建EIF3F稳定敲低细胞系，Western Blot证实蛋白表达显著抑制。功能实验显示，敲低EIF3F后，Huh7和HepG2细胞的迁移速率降低（伤口愈合实验）、克隆形成能力下降（平板克隆实验）、Transwell侵袭细胞数减少、CCK-8检测显示48小时内细胞增殖受抑，证实EIF3F通过协同调控迁移、侵袭和增殖促进HCC恶性进展。
In vivo experiment：裸鼠皮下移植瘤模型显示，shEIF3F组的肿瘤体积和重量较对照组显著降低，肿瘤重量下降6.8倍，表明EIF3F敲低在体内可显著抑制HCC生长。
研究结论与讨论部分强调，本研究首次系统解析了MAFLD-HCC共病过程中DUBs介导的分子调控网络，构建的DUBS系统不仅是可靠的HCC独立预后标志物，还能精准预测免疫治疗响应和化疗药物敏感性，为个体化分层治疗提供了客观依据。核心基因EIF3F兼具MAFLD与HCC的跨疾病诊断价值，其通过稳定ACSL4（长链脂酰辅酶A合成酶4）促进脂肪酸生物合成，并通过调控CD8+T细胞功能塑造免疫抑制微环境，是潜在的精准治疗靶点。尽管研究未开展前瞻性临床样本验证和候选药物体内疗效评价，但其多组学整合分析策略和DUBS系统的临床转化潜力，为HCC的早期筛查、预后监测和治疗方案优化提供了新的分子工具和理论支撑，未来需通过多中心前瞻性临床试验进一步验证其应用价值。
