《Stem Cell Reviews and Reports》：Characterization and Validation of Long-Term Cultured TERT-Immortalized Human Wharton’s Jelly–Derived Mesenchymal Stromal Cells
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本研究致力于解决间充质基质细胞（MSCs）临床应用中的一大瓶颈——复制性衰老导致早期传代细胞数量有限、质量难以保证的问题。团队通过hTERT基因永生化处理，成功构建了可长期传代（至P30）的TERT-MSCs，并系统验证了其在形态、表面标志、分化潜能、端粒长度、旁分泌功能及细胞保护/抗炎效应方面的稳定性。结果表明，TERT-MSCs在长期培养中依然保留早期传代MSCs的关键特性与治疗潜力，为MSC规模化生产和细胞治疗标准化提供了有前景的技术平台。
在干细胞疗法蓬勃发展的今天，间充质基质细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）以其多向分化潜能、强大的免疫调节能力和组织修复功能，成为再生医学领域一颗璀璨的明星。无论是脊髓损伤、心肌梗死，还是自身免疫性疾病，临床前和临床研究都展示了MSCs巨大的应用潜力。然而，一个关键的技术瓶颈始终横亘在科研人员与临床应用之间：MSCs在体外扩增时会遭遇“复制性衰老（replicative senescence）”。这意味着，从宝贵的供体组织（如骨髓、脐带血、沃顿胶）中分离出的MSCs，通常只能在体外稳定传代大约6-10代。超过这个限度，细胞不仅增殖能力急剧下降，其端粒长度缩短，更重要的是，那些赋予其治疗价值的核心功能——如分泌促愈合因子、保护受损细胞、抑制过度炎症的能力——也会随之衰退。这就好比一支精锐部队，在投入战场前就因“自然老化”而战斗力锐减。为了获得足量的细胞用于一次治疗或研究，科学家们往往不得不频繁寻找新的供体，重新建立细胞库，这带来了巨大的时间成本、经济负担，更关键的是引入了无法避免的“供体间差异”，让治疗效果难以预测和标准化。如何突破这一限制，获得能够稳定、长期扩增且不丢失功能的MSCs，是推动MSC疗法从实验室走向更广阔临床应用的“卡脖子”难题。
为了解决这一难题，一项发表在《Stem Cell Reviews and Reports》期刊上的研究进行了开创性的探索。研究团队将目光投向了一个与细胞衰老密切相关的基因——人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）。端粒酶是维持染色体末端端粒长度的关键，而端粒的缩短正是细胞衰老的重要标志。理论上，通过基因工程手段让MSCs过表达hTERT，或许能“永生化”这些细胞，让它们摆脱复制性衰老的宿命。但一个核心问题随之而来：这种经过基因改造的MSCs，在长期传代后，还能不能保持“初心”——即天然MSCs的生物学特性和治疗功能？为了回答这个问题，研究人员开展了一项系统而严谨的研究。他们从人沃顿胶（Wharton’s jelly）中分离出MSCs，在第6代（P6）时，通过逆转录病毒转导技术，使其过表达hTERT基因，从而构建了永生化细胞系（TERT-MSCs）。随后，他们将这批细胞长期培养至第30代（P30），并以未经过基因处理的早期传代（P8）MSCs作为对照，从多维度评估了TERT-MSCs在长期传代过程中的“变”与“不变”。研究结论令人振奋：TERT-MSCs在传代至P30时，依然成功维持了早期传代MSCs的关键特征和治疗潜力，包括典型的细胞形态、表面标志物表达、多向分化能力，以及至关重要的细胞保护和抗炎功能。这一发现为获得稳定、均一、可大规模扩增的MSCs来源提供了强有力的实验证据，是迈向标准化、规模化MSC疗法生产的关键一步。
为开展此项研究，作者运用了多项关键技术方法。细胞来源为人沃顿胶来源的MSCs。核心的永生化技术是使用携带hTERT基因的逆转录病毒载体进行转导。细胞表征方面，综合运用了流式细胞术分析表面标志物、三系（成骨、成脂、成软骨）分化诱导染色、核型分析以及细胞倍增时间测定。功能验证层面，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测TERT蛋白及旁分泌因子（如脑源性神经营养因子BDNF、血管内皮生长因子VEGF、肝细胞生长因子HGF）水平；通过实时定量PCR（qPCR）检测TERT mRNA和相对端粒长度。体外效力研究则构建了过氧化氢（H2O2）诱导的肺上皮细胞氧化应激损伤模型，以及脂多糖（LPS）和凝血酶（thrombin）诱导的巨噬细胞/小胶质细胞炎症模型，以评估细胞的保护与抗炎作用。此外，研究还采用了高分辨率的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，结合差异表达基因分析和基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析，在转录组水平系统比较了不同组别细胞的异同。
研究结果
细胞表征
TERT-MSCs在传代至P13和P30时，仍保持典型的梭形或多角形形态，与P8对照MSCs无异。其群体倍增时间与细胞累积倍增曲线与早期传代MSCs相似。更重要的是，TERT-MSCs在P13和P30时仍保有向软骨、骨、脂肪细胞分化的能力，表面标志物（CD90、CD105、CD73阳性，CD14、CD45、HLA-DR阴性）表达稳定，且核型分析未发现染色体异常。这些结果表明，TERT-MSCs的“干细胞”基本属性在长期培养中得以完好保存。
TERT过表达验证
在蛋白水平，未转导的对照MSCs中TERT表达量从P10左右开始随传代显著下降，而TERT-MSCs中的TERT蛋白水平直至P30都保持稳定。相应地，TERT-MSCs的端粒长度也显著长于对照MSCs，且能稳定维持至P30，而对照MSCs的端粒则随传代进行性缩短。在mRNA水平，无论是scRNA-seq还是qPCR结果均一致显示，TERT-MSCs在P13和P30时TERT基因表达显著升高，而在亲本对照MSCs中几乎检测不到。
TERT-MSCs的细胞保护与抗炎效应
在功能层面，研究通过H2O2诱导的肺上皮细胞损伤模型发现，早期传代（P6， P9）对照MSCs具有显著的细胞保护作用，但此作用在后期传代（P15， P19）细胞中逐渐丧失。与此同时，关键旁分泌因子BDNF、VEGF、HGF的水平也随传代下降。然而，无论是P13还是P30的TERT-MSCs，其细胞保护效应均与P8对照MSCs相当。在LPS或凝血酶诱导的巨噬细胞/小胶质细胞炎症模型中，TERT-MSCs（P13， P30）也表现出与P8对照MSCs相似的、能够显著降低促炎细胞因子IL-1β和IL-6水平的抗炎能力。scRNA-seq分析进一步证实，表达BDNF和VEGF的细胞比例、以及旁分泌信号相关基因（如RAB27A, VAMP1等）和外泌体标志物（如TSG101, CD81等）的模块评分，在对照组与TERT-MSCs组间均无显著差异。
TERT-MSCs的生理变化
scRNA-seq的差异表达基因分析显示，与对照MSCs相比，TERT-MSCs在“生物过程”类别中，与DNA代谢、有丝分裂纺锤体组织、RNA合成相关的基因本体（GO）术语显著富集，提示其核内及生物合成活性增强。增殖标志物Ki-67阳性细胞比例增加，而衰老标志物CDKN2A阳性细胞比例减少，且此趋势在P13和P30的TERT-MSCs中保持一致。
UMAP聚类模式与TERT-MSCs中簇特异性GO术语富集
UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）可视化显示了早期传代对照MSCs与TERT-MSCs在P13和P30时不同的细胞聚类模式。在对照MSCs中，簇0（Cluster 0）占主导（超过75%细胞），而在TERT-MSCs中，簇0比例减少，簇1和簇2比例增加。不过，对各组（对照、TERT-MSC_P13、TERT-MSC_P30）主要GO术语的对比分析发现，各组间顶级GO术语（如胞质翻译、氧化磷酸化）基本保守，没有显著差异。
研究结论与讨论
本研究系统证实，通过hTERT过表达实现永生化的沃顿胶来源MSCs，在长期传代（直至P30）过程中，能稳定维持其作为MSCs的关键身份特征（形态、表面标志、分化潜能）、端粒长度以及核心的治疗功能（细胞保护与抗炎）。这为解决MSCs临床应用中的复制性衰老和供体间异质性难题提供了一个极具潜力的方案。研究特别指出，TERT-MSCs在细胞裂解物中可检测到TERT蛋白，但在其条件培养基和分离出的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）中，TERT水平均低于检测限，且软琼脂实验未观察到锚定非依赖性生长，这初步缓解了对其潜在致瘤性的安全担忧。因此，TERT-MSCs可被视为一个稳定的、用于规模化生产细胞游离疗法（如EV疗法）的“细胞工厂”，其产品能保持批次间一致性。单细胞测序揭示的细胞亚群比例变化（增殖相关簇增多）以及胞质翻译相关通路富集，提示TERT过表达可能带来除维持端粒外的其他生理变化，这值得在后续研究中进一步关注其长期生物学效应。总之，该研究成功构建并验证了长期培养后功能稳定的TERT-MSCs，为推进MSC疗法，特别是基于EV的细胞游离疗法，走向标准化、规模化生产奠定了重要的实验基础。当然，在考虑任何临床转化之前，全面的临床前安全评估，包括体内毒性、致瘤性、免疫原性等研究，仍然是必不可少的步骤。
