《International Journal of Medical Microbiology》：Virulent phages MM-1 and MM-2 attack enterohemorrhagic Escherichia coli and Salmonella enterica strains
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肠出血性大肠杆菌（EHEC）是重要的人类病原体，控制其感染是当务之急。研究人员针对这一问题，从当地污水处理厂分离并鉴定了两株烈性尾病毒vB_EcoS_MM-1和vB_EcoS_MM-2。研究发现，这两株噬菌体属于Tequintavirus属，具有广泛的pH和温度稳定性，不仅能有效抑制EHEC O157:H7菌株EDL933的生长，且感染后并未显著诱导其Stx2a毒素基因的表达。这项研究为利用噬菌体进行食品安全控制（生物防治）和潜在的噬菌体疗法提供了有前景的新型候选制剂。
享用新鲜蔬果时，你是否担心过潜藏的致命细菌？肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）正是这样一种危险的食源性病原体，其代表性菌株O157:H7可引起严重的出血性结肠炎，甚至导致危及生命的溶血性尿毒综合征（Hemolytic-Uremic Syndrome, HUS）。近年来，随着人们饮食习惯的改变，生食或轻微加工食品的消费日益增多，这也使得EHEC的感染风险与日俱增。抗生素治疗EHEC感染存在争议，甚至可能因诱导细菌的SOS（一种DNA损伤应激）反应而加剧志贺毒素（Shiga toxin, Stx）的释放，加重病情。因此，寻找一种安全、高效的新型防控策略迫在眉睫。在此背景下，裂解性噬菌体（一种专门感染并裂解细菌的病毒）因其对细菌的特异性杀伤能力，被视为极具潜力的生物防治工具。然而，一个关键的科学问题随之浮现：噬菌体裂解细菌的过程本身，是否也会像某些抗生素一样，触发细菌的SOS反应，从而导致Stx毒素的大量表达和释放，反而增加中毒风险？为了回答这个问题，Marina Macho、Vera von Hamm、Herbert Schmidt和Merlin Brychcy开展了一项研究，系统分离并评估了能够靶向EHEC的烈性噬菌体。他们的研究发表于《International Journal of Medical Microbiology》，证实了所分离的两株噬菌体不仅能高效抑制病原菌生长，更重要的是，其感染过程并未显著上调毒素基因的表达，这为噬菌体的安全应用提供了关键证据。
为了开展这项研究，研究人员综合运用了多项关键技术。他们首先从当地污水处理厂采集样本，以EHEC O157:H7菌株EDL933为宿主，通过富集培养和双层琼脂覆盖法分离出噬菌体斑，并经过多次纯化获得高滴度裂解液。利用透射电子显微镜（TEM）观察了噬菌体的形态。通过点斑试验和效率平板测定（EOP）评估了噬菌体的宿主范围。采用一步生长曲线测定了噬菌体的潜伏期和裂解量。通过在不同温度和pH条件下孵育噬菌体悬液，评估了其稳定性。利用牛津纳米孔测序技术对噬菌体基因组进行测序，并使用Pharokka等生物信息学工具进行基因注释和分类学分析。通过培养并感染EHEC O157:H7菌株EDL933，监测细菌生长曲线，并采用实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）技术，检测了在不同感染复数（MOI）下，以及在SOS反应诱导剂诺氟沙星存在时，细菌内stx2a毒素基因的表达水平变化。
3.1. 从污水样本中分离出两株靶向大肠杆菌O157:H7的裂解性噬菌体
研究人员以EHEC O157:H7菌株EDL933为宿主，从污水样本中成功富集并分离出噬菌体，经过纯化获得高滴度裂解液，用于后续表型鉴定、基因组分析和感染实验。
3.2. 噬菌体MM-1和MM-2的形态
透射电镜结果显示，两株噬菌体均为有尾病毒，属于Caudoviricetes目，具有二十面体衣壳和长尾，形态与Siphoviridae相似。噬菌体MM-1的衣壳直径约为82 nm，尾长约为145 nm；MM-2的衣壳直径约为85 nm，尾长约为122 nm。根据命名规则，它们被分别命名为vB_EcoS_MM-1（MM-1）和vB_EcoS_MM-2（MM-2）。
3.3. 噬菌体MM-1和MM-2的基因组分析
基因组测序分析表明，两株噬菌体均属于Demerecviridae科Markadamsvirinae亚科下的Tequintavirus属，基因组大小约为118,000 bp的线性双链DNA，两者序列一致性高达99.82%。基因组注释显示它们包含噬菌体组装、裂解和宿主接管所需的所有基因，并且生物信息学分析（bacphlip和PhageLeads）证实其为烈性噬菌体，不含抗菌素耐药性和毒力基因。系统发育分析（VICTOR）和基因组比对（clinker）进一步确认了它们的分类地位，并显示与已知的T5-like噬菌体（如EC148、T5_ev212）在遗传结构上高度保守，但也存在差异。
3.4. 噬菌体MM-1和MM-2的宿主范围不限于大肠杆菌O157:H7/H
通过点斑试验对多种EHEC临床分离株、产志贺毒素大肠杆菌（STEC）食物分离株以及肠道沙门氏菌血清型进行测试。结果显示，两株噬菌体能裂解所有测试的O13、O26、O103和O157血清型菌株，以及全部四个粗糙型大肠杆菌菌株。此外，它们还能感染并裂解所有测试的肠道沙门氏菌血清型（肠炎、森夫顿堡、鼠伤寒），但对其他肠杆菌科代表菌（如肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌等）无效。效率平板测定（EOP）结果显示，两株噬菌体在所有可裂解菌株上表现出相似的裂解效率，其中MM-2的效率略高。
3.5. 噬菌体MM-1和MM-2显示出Tequintaviruses的典型裂解量
通过一步生长曲线测定，噬菌体MM-1和MM-2感染宿主大肠杆菌W3110的最佳感染复数（MOI）分别为0.01和0.1。两者的潜伏期相对较短（MM-1约15分钟，MM-2约20分钟），裂解量均约为100 PFU mL-1。
3.6. 噬菌体MM-1和MM-2表现出较高的温度和pH稳定性
稳定性测试表明，两株噬菌体在4°C至50°C的广泛温度范围内保持稳定，在60°C时滴度下降约半个对数，在70°C时显著下降至约106PFU mL-1。在pH 3至12的广泛范围内，噬菌体滴度保持稳定，但在pH 1和2时完全失活。
3.7. 噬菌体感染后大肠杆菌O157:H7菌株EDL933的生长受到强烈抑制
用不同MOI（0.1, 1, 10）的噬菌体感染EHEC O157:H7菌株EDL933。结果显示，感染后0.5小时细菌生长即受到抑制，2小时后达到高度抑制并持续5小时。其中，MOI为1时抑制效果最强，MM-1和MM-2分别使细菌生长降低了约97%和93%。
3.8. 噬菌体MM-1和MM-2的感染不会上调stx2a表达，即使在诱导SOS反应的条件下也是如此
通过qRT-PCR检测噬菌体感染后stx2a基因的表达。结果表明，在MOI为0.1、1和10时，与未感染的对照组相比，两种噬菌体感染均未导致stx2a表达的显著上调。即使在同时使用SOS反应诱导剂诺氟沙星（100 ng mL-1）的情况下，噬菌体感染也并未导致stx2a表达上调；而单独使用诺氟沙星则显著诱导了stx2a的表达。
综合以上结果，本研究成功从污水样本中分离出两株新型烈性噬菌体vB_EcoS_MM-1和vB_EcoS_MM-2。研究结论指出，这两株噬菌体属于Tequintavirus属，具有对重要临床EHEC血清型、食源性STEC以及常见沙门氏菌血清型的广泛宿主范围。它们在4°C至60°C和pH 3至12的宽泛条件下保持稳定，具有较短的潜伏期（约15-20分钟）和典型的裂解量（约100 PFU mL-1）。更重要的是，噬菌体能够有效抑制大肠杆菌O157:H7菌株EDL933的生长，且在感染后（即使在高MOI或存在SOS反应诱导剂的情况下）并未显著上调其stx2a毒素基因的表达。讨论部分强调，污水是分离病原体靶向噬菌体的丰富来源。基因组中存在的tRNA基因可能有助于其广泛的宿主范围。噬菌体对粗糙型大肠杆菌的裂解能力表明其受体识别可能不依赖于O抗原，这扩大了其潜在应用范围。相较于其他已报道的EHEC噬菌体，MM-1和MM-2在较低MOI下即表现出强效抑制，且具有更优的温度和pH稳定性，这使其更适用于食品工业中的各种环境。最关键的安全性问题得到解答：噬菌体裂解未诱导毒素表达，这降低了应用噬菌体进行生物防治时可能加剧中毒的风险。因此，本研究凸显了vB_EcoS_MM-1和vB_EcoS_MM-2作为对抗EHEC的有前途且高效的生物防治剂，在食品安全应用和未来噬菌体疗法领域具有重要的潜在价值。
