《International Journal of Molecular Sciences》：Self-Assembling Short Peptide Carriers for Gene Delivery
Longyu An,
Zhanyao Xu and
Xiaoming Zhang
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这篇综述系统性探讨了自组装短肽作为下一代基因递送平台的潜力。它从化学基础到临床转化，详细阐述了肽与核酸的共组装机制、纳米结构的理性设计、以及如何克服关键的生理与胞内屏障（如细胞摄取、内体逃逸、载体解组装）。文章重点分析了其在mRNA疫苗和CRISPR/Cas9基因编辑等前沿应用中的前景，并指出了当前向临床转化面临的主要挑战和未来智能化、多功能化的发展方向。
基因治疗被誉为继小分子药物和抗体疗法之后的第三次医学革命，其目标是通过引入、编辑或沉默特定核苷酸序列，从根源上矫正遗传缺陷。然而，其成功严重依赖于安全高效的递送系统。传统的病毒载体存在免疫原性和插入突变风险，而合成聚合物等非病毒载体则常受限于细胞毒性和较差的胞内递送效率。本篇综述聚焦于自组装短肽，这类由5-30个氨基酸组成的寡聚体，因其独特的可编程性、优异的生物相容性和自组装能力，被视为克服现有递送瓶颈的理想非病毒平台。
短肽与遗传物质的相互作用及自组装机制
短肽与核酸的共组装并非简单混合，而是由多种非共价相互作用的动态平衡所驱动的复杂过程。静电相互作用是带正电荷的肽段与带负电的核酸磷酸骨架结合的主要驱动力，其导致的电荷中和效应促使核酸塌缩形成致密纳米结构。氢键网络则作为内部几何构型的“骨架”，引导肽链从无规卷曲转变为有序的二级结构（如β-折叠），进而堆叠形成高长径比的纳米纤维或纳米带。疏水相互作用是驱动两亲性肽自组装成胶束、囊泡等“核-壳”结构的主要力量，疏水氨基酸残基在水中聚集以最小化界面能。π-π堆积则通过芳香族残基侧链的特异性堆叠模式，形成类似“空间拉链”的致密芳香簇，赋予组装体卓越的机械刚性和对酶解的抗性。
这些力的协同作用，最终导向三种典型的自组装纳米结构：一维的纳米管/纳米纤维、零维的纳米囊泡/胶束，以及三维的水凝胶网络。其中，纳米纤维因其高负载能力和模拟细胞外基质的特性而备受关注；囊泡和胶束则具有各向同性的几何形状，有利于在生物流体中的运输；而水凝胶网络则能通过物理缠结形成立体屏障，显著延长基因货物的生物半衰期，实现持续释放。
细胞内递送的关键步骤
短肽载体要成功递送基因，必须依次跨越细胞摄取、内体逃逸和细胞内释放三大关键生理屏障。
细胞摄取主要通过网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞和巨胞饮等途径。肽载体的性质，如其表面电荷、拓扑结构和氨基酸组成，深刻影响摄取效率。例如，富含精氨酸的肽段因其胍基基团能与细胞膜形成稳定的双齿氢键，显示出远超其他阳离子肽的膜转位能力。此外，在纳米载体表面展示多个肽段产生的“多价效应”，能指数级提高与细胞表面受体的结合亲合力，从而大幅提升内吞效率。
成功进入细胞后，载体必须尽快从内体中逃逸，避免被递送至溶酶体降解。短肽载体主要利用几种机制实现逃逸：1. 质子海绵效应：组氨酸的咪唑侧链pKa值介于胞外和内体pH之间，在内体酸性环境中被质子化，缓冲质子 influx。为维持酸化，质子泵不断工作，伴随氯离子内流，导致内体渗透压升高、肿胀并最终破裂。2. 膜破坏：许多两亲性肽在酸性条件下会发生构象转变，从无规卷曲变为α-螺旋，并插入内体膜，通过形成跨膜孔道或引起膜不稳定来实现物理性破坏。3. 酶触发逃逸：利用病理组织中（如肿瘤微环境）或特定细胞器内酶浓度的差异，设计可被特定酶切割的肽序列。酶切导致载体结构发生程序性重排，从稳定的载体状态转变为具有膜裂解活性的形式。
胞内释放与基因表达是最后一步。载体需要在胞质中解组装以释放基因货物。一种常见策略是引入半胱氨酸，在氧化性的细胞外环境中形成二硫键“锁”定组装体，提高稳定性。进入还原性的胞质后，高浓度的谷胱甘肽会还原裂解二硫键，触发载体解体和货物释放。对于DNA等需要进入细胞核的货物，通常还需在肽序列中整合核定位信号以辅助其穿越核孔复合体。对于作用于胞质的mRNA或CRISPR-Cas9核糖核蛋白，成功的内体逃逸即是递送过程的终点。
前沿应用与代表性研究
短肽载体在多种前沿基因治疗模式中展现出巨大潜力。
在RNA递送方面，针对mRNA，设计具有特定α-螺旋结构的肽（如hPep3），使其一面富集带正电赖氨酸以压缩mRNA，另一面展示疏水亮氨酸以稳定纳米颗粒，已在非人灵长类模型中成功诱导治疗性蛋白表达。对于siRNA，其刚性短链结构使其难以被压缩，通过将色氨酸和精氨酸进行特殊空间排列设计的“WRAP”系列肽，可快速将其“包裹”成均质纳米颗粒，显著增强细胞摄取。在tRNA治疗等前沿领域，短肽组装体也显示出潜力。
在CRISPR-Cas9基因编辑工具递送方面，直接递送预组装的Cas9核糖核蛋白能避免基因组整合风险并减少脱靶效应，但RNP分子量大、带负电，递送挑战巨大。短肽通过可调的电荷密度和膜裂解能力成为优秀载体。例如，hPep3系统通过诱导快速内体破裂，在HEK293T细胞中实现了高达90%的碱基编辑效率。PERC系统在原代T细胞中实现了高效率的基因敲除，且细胞毒性远低于电穿孔法。
为实现靶向递送与联合治疗，可通过固相肽合成将靶向配体（如特异性识别整合素受体的RGD序列）共价整合到肽载体上，实现从被动扩散到主动靶向的转变。进一步，短肽组装体独特的两亲性结构使其能够同时封装疏水化疗药物和吸附核酸药物，构建协同给药系统。例如，RGD功能化的肽可与Bcl-2反义寡核苷酸共组装，并同时负载阿霉素，实现对同一细胞的同步递送，克服药物不同药代动力学导致的“时空错配”，实现协同抗肿瘤效果。
挑战与未来展望
尽管前景广阔，短肽载体的临床转化仍面临四大挑战：体内稳定性（易被蛋白酶降解）、靶向特异性（脱靶毒性）、规模化生产与质量控制（合成成本高、杂质分离难），以及免疫原性与长期毒性。未来的发展方向是推动载体从“被动适应”向“主动智能”演进。这包括设计能整合pH、酶、氧化还原等多维信号响应的智能动态系统；利用人工智能辅助理性设计，加速载体开发；通过全链条生物仿生设计模拟病毒的高效感染机制；构建集诊断与治疗于一体的诊疗一体化平台；并最终解决从实验室到临床的工程化放大难题。通过跨学科合作与技术创新，自组装短肽有望引领下一代基因递送技术的发展，为众多难治性疾病带来新的治愈希望。
