利用发根农杆菌介导的发状根平台快速优化生菜CRISPR/Cas体系及验证sgRNA效率

《Plants》：A Rapid Hairy Root-Based Platform for CRISPR/Cas Optimization and Guide RNA Validation in Lettuce Alberico Di Pinto, Valentina Forte, Chiara D’Attilia, Marco Possenti, Barbara Felici, Floriana Augelletti, Giovanna Sessa, Monica Carabelli, Giorgio Morelli and Fabio D’Orso + 1 author

本研究针对生菜基因编辑中缺乏快速sgRNA验证平台的瓶颈，开发了基于高效菌株ATCC15834的发状根转化系统，并通过对比启动子（如PcUbi、AtpU6-26）及多种Cas核酸酶（SpCas9/SaCas9/LbCas12a），实现对LsHB2基因的高效编辑与突变定量分析，为作物精准育种提供可靠工具。

　　

随着全球人口增长与农业集约化发展，提高作物产量与抗逆性成为现代农业的核心挑战。生菜作为全球广泛种植的叶类蔬菜及菊科功能基因组学的新兴模式植物，虽拥有高质量参考基因组与稳定转化体系，但其CRISPR/Cas基因编辑仍面临两大难题：一是缺乏快速验证引导RNA（gRNA）编辑效率的平台，二是不同启动子与核酸酶组合对编辑效果的影响尚不明确。传统计算机预测gRNA效率的工具多基于动物数据训练，在植物体系中可靠性有限，而稳定的植株转化周期长、成本高，限制了生菜基因编辑的应用步伐。为此，Alberico Di Pinto等研究人员在《Plants》发表研究，旨在建立一套高效、快速的发状根（Hairy Root）平台，用于优化生菜CRISPR/Cas体系并验证gRNA性能，加速作物精准育种进程。

本研究采用的关键技术包括：①通过比较四种发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株（ATCC15834、MSU440、K599、pARQUA）在两个生菜品种（‘Osiride’罗马型、‘Saladin’冰山型）中的侵染效率，筛选最优菌株；②利用绿色荧光蛋白（GFP）报告系统评估病毒来源的双35S启动子（2×p35S–Ω）与植物来源的欧芹泛素启动子（PcUbi）的表达差异；③采用Golden Gate模块化克隆（MoClo）构建含不同启动子与核酸酶（SpCas9、SaCas9、LbCas12a）的CRISPR载体；④通过发状根转化结合桑格测序与ICE软件（Inference of CRISPR Edits）定量分析插入/缺失（Indel）频率与突变谱。

2.1 筛选诱导生菜发状根的高效发根农杆菌菌株

研究人员首先评估四种发根农杆菌菌株在生菜子叶外植体中的侵染效率。结果显示，菌株ATCC15834在‘Saladin’和‘Osiride’中的发状根诱导率分别达40%和70%，平均每外植体产生4条发状根，显著优于其他菌株。超过90%的发状根携带NPTII标记基因，证明转化成功。这一结果表明ATCC15834是生菜发状根转化的最佳菌株，为后续CRISPR体系验证提供了高效平台。

2.2 选择驱动发状根高效基因表达的启动子

为优化CRISPR载体架构，研究人员比较了2×p35S–Ω与PcUbi启动子在发状根中的表达性能。共聚焦显微镜观察显示，PcUbi驱动的GFP表达强度显著更高：45%的发状根呈现“极强”荧光，而2×p35S–Ω组无此类事件。这可能是由于35S启动子在生菜中易受CpG/CpWpG位点超甲基化影响导致沉默。因此，PcUbi更适合用于核酸酶的高效表达。

2.3 靶向拟南芥HD-Zip II基因同源物ATHB2的生菜直系同源基因LsHB2

研究选择参与避荫反应（Shade Avoidance Response, SAR）的HD-Zip II家族转录因子LsHB2（拟南芥ATHB2直系同源）为目标基因。通过CRISPOR工具设计针对其DNA结合结构域（Homeodomain, HD）编码区的gRNA，包括SpCas9的Sp-sg73/Sp-sg74、SaCas9的Sa-sg27及LbCas12a的cr56/cr61/cr101，均位于外显子3与内含子3交界区，旨在破坏DNA结合活性或剪接位点。

2.4 比较短合成与天然U6启动子优化gRNA表达

研究人员对比了拟南芥天然AtpU6-26启动子与75bp合成pU6共识启动子在sgRNA表达中的效率。ICE分析显示，AtpU6-26驱动Sp-sg73的编辑根比例达84%（vs pU6共识的70%），且高Indel频率（ICE评分>75%）事件更多。这表明天然启动子在生菜发状根中更有效，应优先用于CRISPR构建体。

2.5 验证CRISPR构建体并与计算预测比较

整合上述优化条件后，研究人员评估了不同核酸酶的编辑效率。结果显示，所有gRNA均有效，但效率差异显著：Sp-sg73编辑率达84%，而LbCas12a的cr56/cr61达100%。与计算机预测对比发现，Fusi/Doench/Azimuth等算法对SpCas9和LbCas12a的预测与体内结果一致性低，仅SaCas9的预测较准确。此外，SpCas9产生的Indel谱更窄（多为1bp插入），而LbCas12a则产生广泛的缺失突变。KO评分（预测功能敲除比例）普遍高于计算值，说明实际敲除效果优于预期。

讨论与结论

本研究建立了生菜中首个系统优化的发状根CRISPR验证平台，解决了gRNA快速验证的瓶颈。通过筛选高效菌株ATCC15834、确定PcUbi与AtpU6-26为最优启动子组合，实现了核酸酶与sgRNA的高效表达。靶向LsHB2基因的实验证明，该平台可量化不同gRNA的编辑效率、突变类型（如移码突变、框内缺失）及嵌合程度，为后续稳定转化提供可靠依据。更重要的是，研究发现计算机预测工具在植物体系中的局限性，强调了实验验证的必要性。该平台不仅适用于生菜，还可推广至向日葵等其他菊科作物，加速作物功能基因组研究与精准育种应用。