沙门氏菌是一种革兰氏阴性细菌，常见于各种食品、原材料以及与工业食品加工相关的环境中（Besser, 2018; Du Toit, 2021）。由于其能够在恶劣条件下存活、侵入宿主细胞并在人体内系统传播，它被认为是最重要的食源性病原体之一（Gao et al., 2020; He et al., 2021）。感染通常由食用受污染的食品引起，尤其是肉类、鸡蛋和乳制品（Hice et al., 2018; Sui et al., 2026）。临床症状包括严重腹泻、发热、呕吐和腹绞痛，症状在接触后8至72小时内出现（Roth-Konforti et al., 2019）。尽管已采取大量措施确保食品安全，但沙门氏菌仍然是一个重大的公共卫生问题，尤其是随着耐药菌株的增加（Li et al., 2021a），这一问题更加突出。这些挑战导致高住院率，并给全球经济带来沉重负担（Wang et al., 2024a）。因此，迫切需要一种简单、成本低廉、准确、集成在工艺流程中且可现场应用的检测方法来有效控制沙门氏菌暴发。
目前检测沙门氏菌的标准方案（ISO 6579-1）包括预富集、选择性富集和接种等步骤，通常需要几天到一周的时间才能完成（Cooper et al., 2024; Li et al., 2021b）。在临床实践中，漫长的病原体鉴定过程常常导致患者错过关键的治疗窗口（Xu et al., 2022）。为了解决这一限制，人们开发了聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等替代方法，以实现无需细菌培养的直接样本分析（Váradi et al., 2017），显著加快了病原体检测速度（Kasturi and Drgon, 2017; Kumar et al., 2008; Malorny et al., 2004）。然而，DNA提取、扩增和检测的过程通常需要在实验室环境中进行，耗时2至6小时（Lee et al., 2015）。尽管ELISA应用广泛，但它依赖于抗体，而抗体价格昂贵且易受环境条件影响，从而增加了假阳性和假阴性的风险，并降低了整体灵敏度（Jain et al., 2012）。此外，复杂的程序（包括抗体固定、目标识别和催化反应）延长了分析时间，阻碍了即时检测技术的实现（He et al., 2020; Xu et al., 2024）。因此，对于易腐烂、保质期短的食品中的沙门氏菌的现场检测，现有方法在操作简便性和准确性方面仍面临重大挑战，需要进一步创新。
等温扩增技术提供了一种在恒定温度条件下高效扩增核酸的替代方法（Wang et al., 2024b; Wang et al., 2025b; Xia et al., 2022）。在当前的分子扩增方法中，重组酶聚合酶扩增（RPA）因其能够在约20分钟内快速扩增DNA和RNA而备受关注，无需复杂的温度循环设备（Lobato and O'Sullivan, 2018; Munawar, 2022; Tan et al., 2022）。目前，RPA试剂盒以冻干粉末或颗粒的形式商业化，便于长期储存和运输，适用于即时检测（Daher et al., 2016）。尽管RPA在速度和灵敏度方面具有显著优势，但其特异性相对较低（Daher et al., 2015; Li et al., 2019）。因此，单独使用RPA扩增产物无法可靠地确认目标病原体的存在，尤其是在背景复杂的实际样本中。为了克服这一限制，将CRISPR/Cas系统与RPA结合，建立了双重识别策略。这种组合不仅提高了检测灵敏度和特异性，还将核酸扩增转化为明确的光学信号，使得结果解释更加快速和直接（Guo et al., 2023; Zhou et al., 2025）。
CRISPR/Cas12a是一种RNA引导的内切酶，当它识别并结合到目标DNA上时，会激活针对非特异性单链DNA（ssDNA）的切割活性（Chen et al., 2018; Sui et al., 2025; Xu et al., 2025）。虽然基于CRISPR/Cas12的平台在分子诊断方面显示出巨大潜力（Wang et al., 2025a; Yan et al., 2025），但传统的CRISPR/Cas12辅助RPA方法依赖于RPA过程中生成的双链DNA（dsDNA）中的原间隔序列（PAM）的存在。这一PAM要求使得引物设计变得复杂，当目标序列缺乏合适的PAM位点时会影响检测方法的开发。为了克服与PAM可用性和可访问性相关的限制，不对称RPA（aRPA）通过高效地将少量dsDNA转化为丰富的ssDNA提供了可行的解决方案（Yang et al., 2024）。尽管一些现有方法使用aRPA生成的ssDNA来激活Cas12a以实现PAM独立的检测（Cao et al., 2023; Zou et al., 2025），但每个ssDNA分子仅激活一个crRNA/Cas12a复合体，这种一对一的激活机制限制了信号放大，减少了二次信号增强的机会，从而降低了整体检测灵敏度。
鉴于aRPA能够高效地将低丰度的双链DNA转化为单链DNA（ssDNA），我们设计了一种基于杂交链反应（HCR）的信号转导策略来进一步增强CRISPR/Cas12a的激活效果。具体来说，引入了一种由三个发夹DNA结构组成的简单通用HCR电路，与aRPA并行工作（Jia et al., 2022）。在该系统中，aRPA生成的ssDNA作为触发HCR的启动剂，从而形成含有多个重复PAM位点的长双链DNA聚合物。这种结构转变使得单个目标衍生的ssDNA分子能够诱导Cas12a的空间有序、多点激活（Rossetti et al., 2022），从而将传统的单输入-单激活模式转变为单输入-多激活过程。结果，可以从单个目标分子招募并激活多个Cas12a蛋白，导致报告基因底物的快速切割和信号增强。除了提高扩增效率外，HCR电路还提供了内在的可编程性。通过修改初始发夹模块中的识别序列，系统可以轻松适应不同核酸目标的检测，而不需要目标序列中存在PAM位点。这种将目标识别与PAM限制解耦的方法解决了基于CRISPR的诊断中的关键问题，扩展了平台的通用性。基于这一设计，我们开发了一种aRPA-HCR/Cas12a级联系统，将不对称扩增、可编程信号转导和CRISPR介导的检测集成在一个简化的单管工作流程中。该系统能够灵敏且选择性地检测S. enteritidis，对非目标食源性病原体表现出强特异性，并在复杂的食品基质中表现出良好的性能。这些结果凸显了其作为现场食品安全监测实用且用户友好工具的潜力。
