利用CRISPR/Cas9技术在Lemna minor中实现靶向多重基因敲除

《Transgenic Research》：Targeted multiplex gene knockouts in Lemna minor using CRISPR/Cas9

水绵作为生物反应器的优势及基因编辑潜力。研究采用PTG-Cas9系统多向编辑水绵特异性糖基转移酶基因FucT和XylT，成功诱导 frameshift突变，并通过PCR、RT-PCR和Western blot验证突变体，首次在L.minor中实现PTG系统多基因编辑。

　　

摘要

Lemna minor（俗称浮萍）是一种生长迅速的水生植物，被认为是一种有前景的绿色生物反应器，可用于重组蛋白的生产。其快速繁殖、高蛋白质产量、环境适应性和可食用性使其在生物技术应用中具有很高的吸引力。为了充分利用这些优势并进一步挖掘其生物技术潜力，开发针对该物种的遗传工具至关重要。实现这一目标的关键策略是采用先进的基因组编辑技术，如CRISPR/Cas9系统。尽管多重CRISPR/Cas9基因编辑技术已成功应用于Lemna aequinoctialis，但使用多顺反子tRNA–sgRNA (PTG)/Cas9系统在L. minor中进行多重编辑时，植物内源性tRNA处理系统的能力尚未得到研究。在这项研究中，构建了一个包含四个sgRNA的PTG载体，这些sgRNA旨在同时靶向两个植物特异性的糖基转移酶基因：α-1,3-岩藻糖转移酶（FucT）和β-1,2-木糖转移酶（XylT）。正如预期的那样，PTG-Cas9系统在由转化愈伤组织衍生的L. minor植物中成功诱导了移码突变，表现为插入和缺失（indels）。通过PCR和RT-PCR分析进行验证，并对目标位点进行测序，确认了目标位点上确实存在indels。此外，使用针对XylT和FucT的特异性抗体进行的Western blot分析显示，两个纯合系（44系和217系）中的XylT蛋白均发生截短。在217系中检测到了完整的FucT蛋白，而在44系中则没有FucT的表达。这项研究首次成功展示了在L. minor中使用PTG-Cas9系统进行多重基因组编辑，为该物种的先进遗传工程研究奠定了基础。