《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Teriflunomide Attenuates Demyelination and Enhances Remyelination in Organotypic Brain Slice Cultures Through Modulation of Glial Cell Dynamics
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本研究探讨了特立氟胺（Teriflunomide）在中枢神经系统中的作用机制。为阐明其如何影响胶质细胞，研究人员利用体外脱髓鞘模型（LPC诱导的器官型小脑切片培养，OSC）开展研究。结果显示，特立氟胺治疗可减轻脱髓鞘并增强自发髓鞘再生，这与其调节小胶质细胞密度/增殖相关，而非直接作用于少突胶质细胞。该研究为特立氟胺在复发缓解型多发性硬化（RRMS）治疗中提供新的中枢作用机制见解。
多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）是一种中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘疾病，其核心病理特征包括髓鞘的破坏和神经元的损伤。复发缓解型多发性硬化（Relapsing-Remitting MS, RRMS）是其最常见亚型，患者会经历神经功能缺损的急性发作与部分恢复的反复循环。因此，寻找能够有效延缓疾病进展、保护髓鞘并促进修复的药物，是神经科学领域的重要目标。特立氟胺（Teriflunomide）作为一种口服疾病修正疗法，已于2012年被批准用于治疗RRMS。其经典作用机制被认为是可逆性、非竞争性地抑制线粒体酶二氢乳清酸脱氢酶（Dihydroorotate Dehydrogenase, DHODH），从而通过影响嘧啶的从头合成来减少活化淋巴细胞的增殖，发挥外周免疫调节作用。然而，有证据表明，尽管特立氟胺的血脑屏障穿透率较低，但仍有少量药物（约1%-2%的血药浓度）能够进入脑实质，这意味着它有可能直接作用于中枢神经系统内的胶质细胞，如小胶质细胞和少突胶质细胞。那么，特立氟胺在进入中枢后，是否以及如何影响脱髓鞘和髓鞘再生的进程？它是对胶质细胞产生了直接作用，还是通过复杂的细胞间交互间接发挥效益？解答这些问题，对于全面理解特立氟胺的临床疗效、挖掘其潜在的中枢保护与修复机制至关重要。
为了深入探究特立氟胺在中枢神经系统内的作用，由M.S.、V.G.等人领导的研究团队在《CNS Neuroscience & Therapeutics》上发表了一项研究。他们摒弃了复杂的体内模型，选择了一个能较好保留脑内复杂细胞结构与相互作用的离体系统——器官型脑切片培养（Organotypic Slice Culture, OSC）。具体而言，他们从10日龄小鼠的小脑中制备切片，在体外培养使其髓鞘化，然后利用溶血卵磷脂（Lysolecithin, LPC）诱导局灶性脱髓鞘，从而模拟多发性硬化的关键病理过程。研究人员通过这一精巧的模型，系统评估了特立氟胺对发育性髓鞘形成、LPC诱导的脱髓鞘损伤以及后续自发髓鞘再生过程的影响，并着重分析了其对小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞系细胞动态的调控作用。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先是器官型小脑切片培养（OSC）技术，以此作为模拟体内脱髓鞘与再髓鞘化的离体模型。其次，采用了包括免疫组织化学和免疫荧光染色在内的多种细胞标记与成像技术，使用了针对髓鞘碱性蛋白（MBP）、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）、离子钙接头蛋白1（IBA-1，标记小胶质细胞）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，标记星形胶质细胞）、少突胶质细胞转录因子2（OLIG2）等多种抗体，以量化髓鞘完整性并分析各类胶质细胞的反应。第三，利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）进行了超微结构分析，直观观察并定量评估髓鞘轴突的比例和髓鞘的完整性（g-ratio分析）。此外，研究还结合了原代胶质细胞分离培养技术，分别培养了小胶质细胞、少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte Precursor Cells, OPC）和星形胶质细胞，用以在简化体系中测试特立氟胺的直接与间接效应。最后，通过格里斯（Griess）法检测一氧化氮代谢产物亚硝酸盐浓度，以及使用集落刺激因子1受体（Colony-Stimulating Factor 1 Receptor, CSF-1R）抑制剂BLZ945（sotuletinib）进行小胶质细胞剔除实验，辅助阐明细胞机制。
3.1 特立氟胺不影响OSC中的发育性髓鞘形成
研究人员首先检验了特立氟胺是否影响正常的髓鞘发育。OSC在培养第2天开始接受25 μM特立氟胺处理，持续3或5天。通过髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein, MBP）免疫染色评估发现，与对照组相比，特立氟胺处理并未改变MBP的表达量。这表明，在该模型中，特立氟胺对生理性的发育髓鞘化过程没有显著影响。
3.2 特立氟胺可预防OSC中的脱髓鞘
接下来，研究聚焦于特立氟胺在病理状态下的作用。在培养第7天，用LPC处理切片诱导脱髓鞘。结果显示，LPC处理后第2天（9 DIV），MBP水平显著下降，表明发生严重脱髓鞘。然而，若在LPC处理前1天开始并持续给予25 μM特立氟胺，则能有效阻止MBP的降解，其水平与未处理的对照组无显著差异，而较低浓度（3或10 μM）则无此保护效应。对另一髓鞘标记物髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG）的检测也得到了类似结果。更重要的是，透射电子显微镜的超微结构分析为这一发现提供了坚实证据。定量分析显示，LPC处理使有髓鞘轴突的比例从对照组的82.3%急剧降至7.2%，而联合特立氟胺处理则将该比例部分保留在52.9%。探索性的g-ratio分析也表明，特立氟胺处理组的髓鞘完整性（g-ratio平均值0.77）优于LPC单独处理组（0.95），进一步证实了特立氟胺对髓鞘结构的保护作用。
3.3 特立氟胺给药不影响脱髓鞘过程中的少突胶质细胞动态
为了探究髓鞘保护的细胞学基础，研究人员分析了少突胶质细胞系的变化。在整个脱髓鞘期间，标记所有少突胶质细胞谱系细胞的OLIG2+细胞总数在各实验组间无差异。然而，代表成熟少突胶质细胞的APC+/OLIG2+双阳性细胞数量在LPC处理后第2天显著减少，表明LPC造成了成熟少突胶质细胞的损伤。同时，增殖中的未成熟少突胶质细胞（OLIG2+/Ki-67+）数量在LPC处理后第2天显著增加，但特立氟胺处理并未改变这一增殖反应。这表明，特立氟胺的髓鞘保护作用可能并非通过直接调节少突胶质细胞的存活或增殖来实现。
3.4 特立氟胺介导的脱髓鞘期间髓鞘保护伴随小胶质细胞反应的改变
研究重点转向了中枢神经系统的免疫哨兵——小胶质细胞。免疫荧光染色发现，LPC处理导致小胶质细胞（IBA-1+）总数及其增殖（IBA-1+/Ki-67+）数量在脱髓鞘期显著增加。然而，同时使用25 μM特立氟胺处理，可以显著减弱LPC引起的这种小胶质细胞数量的增加和增殖亢进，使其水平恢复到与对照组相当。与此一致，培养基中亚硝酸盐（一氧化氮代谢产物）的浓度变化也与小胶质细胞密度呈正相关，特立氟胺处理降低了LPC引起的亚硝酸盐水平升高。为了直接验证小胶质细胞数量与髓鞘损伤的关联，研究使用了CSF-1R抑制剂BLZ945来部分剔除小胶质细胞。结果发现，BLZ945处理同样能减少LPC诱导的小胶质细胞增多，并像特立氟胺一样，保护MOG免疫反应性免受破坏。这强有力地表明，限制小胶质细胞的扩张与减轻髓鞘损失存在功能关联。
3.5 特立氟胺在髓鞘再生过程中对少突胶质细胞和髓鞘蛋白表达产生积极影响
在脱髓鞘后的恢复期（再髓鞘化阶段），研究评估了特立氟胺的作用。从LPC处理后第2天开始给予25 μM特立氟胺，持续到第7天。结果发现，与未处理的LPC组相比，特立氟胺处理增强了自发髓鞘再生，表现为MOG阳性髓鞘节段密度增加。同时，成熟少突胶质细胞（APC+）的数量也显著增多。这表明特立氟胺不仅能保护既有的髓鞘，还能促进损伤后的修复过程。
3.6 特立氟胺减少分离的OPC培养物中的细胞数量
鉴于在复杂切片环境中观察到的积极效果，研究人员在简化体系中原代培养OPC，直接测试特立氟胺的影响。出乎意料的是，用3、10或25 μM特立氟胺直接处理OPC 48小时后，无论是在增殖还是分化条件下，A2B5+的OPC总数或GalC+的成熟少突胶质细胞总数均出现下降，提示较高浓度的特立氟胺在缺乏支持性细胞环境时，可能对分离的OPC具有毒性或抑制效应。
3.7 星形胶质细胞上清液防止特立氟胺治疗后OPC的减少
这一矛盾提示，在完整的组织微环境中，可能存在其他细胞提供的保护性信号。于是，研究人员在特立氟胺处理OPC时，加入了未受刺激的星形胶质细胞的条件培养基。结果发现，星形胶质细胞来源的因子完全阻断了特立氟胺导致的OPC数量下降。这说明在OSC或体内，星形胶质细胞可能通过分泌某些支持性因子，中和了高浓度特立氟胺对OPC的潜在负面影响。
3.8 经特立氟胺处理的小胶质细胞上清液对少突胶质细胞培养物无影响
最后，研究测试了特立氟胺是否通过改变小胶质细胞的分泌表型来间接影响OPC。将OPC与经特立氟胺（伴或不伴IL-4刺激）预处理的小胶质细胞上清液共培养，结果显示，OPC的增殖和分化指标均未发生改变。这表明，在本实验条件下，特立氟胺处理后的小胶质细胞并未通过分泌可溶性因子对OPC产生显著的间接调节作用。
本研究通过严谨的离体模型和细胞实验，系统阐明了特立氟胺在多发性硬化相关脱髓鞘与髓鞘再生场景中的中枢作用机制。主要结论可归纳为以下几点：首先，特立氟胺在器官型脑切片培养中展现出明确的髓鞘保护与促再生双重益处，它能显著减轻LPC诱导的急性脱髓鞘损伤，并增强后续的自发髓鞘再生过程。其次，这种有益作用并非源于对少突胶质细胞的直接刺激。相反，在分离培养体系中，较高浓度的特立氟胺甚至对OPC存活不利，但这一效应可被星形胶质细胞来源的因子所逆转，突显了中枢神经系统内细胞间相互作用的重要性。第三，也是本研究的核心发现，特立氟胺的髓鞘保护作用与其调节小胶质细胞动力学密切相关。它能有效抑制脱髓鞘病变引发的病理性小胶质细胞增生与增殖，而通过药物（BLZ945）部分剔除小胶质细胞也能产生类似的髓鞘保护效果，这共同证明了限制小胶质细胞扩张是减轻髓鞘损失的一个有效途径。此外，特立氟胺还能缓解LPC引起的星形胶质细胞形态学上的反应性改变。
综上所述，这项研究为理解特立氟胺治疗RRMS的机制提供了超越外周免疫抑制的新视角。它揭示，特立氟胺能够进入中枢神经系统，并通过调节胶质细胞（尤其是小胶质细胞）的应答动态，在病变局部创造出一个更有利于髓鞘保存与修复的微环境。这一中枢机制与其经典的外周免疫调节作用可能相辅相成，共同构成了其临床疗效的基础。该发现不仅深化了对现有药物作用机制的认识，也为未来开发更多靶向中枢胶质细胞、促进神经修复的多发性硬化疗法提供了重要的理论依据和研究思路。
