《American Journal of Hematology》：Circulating Tumor Cells in Multiple Myeloma: From Peripheral Clues to Central Insights
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本综述系统阐述循环肿瘤细胞（CTC）在多发性骨髓瘤（MM）中的生物学意义与临床价值。文章深入探讨了CTC从骨髓（BM）微环境逸出、在循环中适应及播散的分子机制，重点介绍了以下一代流式细胞术（NGF）和单细胞测序为代表的检测与分子分析技术。CTC不仅具有独立的预后价值，还能作为微小残留病（MRD）监测的补充生物标志物，并有望揭示肿瘤的克隆异质性及进化动态。尽管在标准化和临床整合方面仍面临挑战，但CTC分析正从预后标志物向临床决策工具转变，推动MM的精准医疗发展。
在多发性骨髓瘤（MM）的研究领域，一种名为循环肿瘤细胞（CTC）的特殊细胞群体正吸引着越来越多的目光。这些从骨髓（BM）庇护所中“出走”、进入外周血（PB）循环的恶性浆细胞，不仅反映了疾病的侵袭和播散能力，更为我们打开了一扇动态观察肿瘤生物学的“窗口”。这篇综述将带您深入了解CTC在MM中的前世今生，从它们如何“离家出走”，到我们如何“大海捞针”般捕捉并研究它们，再到它们如何深刻影响临床决策。
CTC在MM中的起源与身份
MM的疾病进程始于意义未明的单克隆丙种球蛋白病（MGUS），经冒烟型多发性骨髓瘤（SMM），最终发展为有症状的MM。传统上，骨髓穿刺是诊断和评估的金标准，但它具有侵入性，且存在取样偏差，难以捕捉肿瘤的空间异质性。相比之下，CTC检测作为一种液体活检手段，提供了微创、可重复的系统性视角。
从历史上看，CTC的概念早在1869年就已提出。在MM中，1906年首次报道了患者外周血中存在非典型浆细胞。当循环浆细胞（CPC）比例≥5%时，则符合浆细胞白血病（PCL）的诊断标准，而低于此阈值的则通常被视为MM相关的CTC。
那么，好端端待在骨髓“家园”里的恶性浆细胞，为何要进入凶险的血液循环？这个过程被称为“逸出”，涉及一系列协调的转录和功能重编程。研究表明，CTC表现出独特的基因表达特征。为了适应循环生存，它们下调了与增殖相关的基因（如CENPF, CDC6），似乎进入了一种静息或休眠状态。同时，它们上调了与细胞骨架重塑、细胞运动和粘附可塑性相关的基因。例如，透明质酸受体CD44的表达显著增加，功能实验证实其能促进细胞向CXCL12迁移并与纤连蛋白粘附。此外，EZR和IQGAP1等支架蛋白的上调，有助于细胞在血管运输过程中的动态粘附转换和机械适应。
另一方面，CTC下调了与骨髓微环境锚定相关的关键粘附分子，如ITGB1(CD29)、ITGA4(CD49d)、NCAM1(CD56)等，这标志着它们与基质的广泛脱离。为了在血流中持续存在，CTC还启动了应激反应和抗凋亡通路，如上调TPT1、DDIT4等基因，以适应代谢转变，增强对免疫攻击和炎症损伤的抵抗力。近期单细胞分析进一步揭示，CTC与配对的骨髓浆细胞在转录上高度相似，高CTC负荷更多反映的是疾病本身固有的侵袭性和基因组复杂性，而非一个独特的、专用于循环的细胞亚群。
CTC揭示空间克隆多样性
对CTC进行基因组分析，不仅能再现骨髓浆细胞的突变图谱，还能暴露额外的克隆复杂性层次。超低深度全基因组测序（ULP-WGS）等研究显示，虽然骨髓中99%的克隆性体细胞单核苷酸变异（SNV）也能在CTC中检测到，但一部分突变（如TP53的亚克隆改变）可能仅存在于循环区室中。这表明CTC提供了更广阔、更动态的肿瘤克隆结构视图，尤其能捕获在标准骨髓样本中空间受限或代表性不足的次要亚克隆。
多区域测序研究也证实了同一患者不同部位（骨髓与骨病变）突变谱存在显著差异。在这种情况下，CTC来源于多个解剖部位，有可能整合来自不同肿瘤生态位的基因组信号，从而提供更全面的系统性疾病表征。尽管CTC与骨髓浆细胞在体细胞突变和臂水平拷贝数变异（CNA）上显示出高度一致性（≥82%和≥95%），但染色体易位的吻合度较低（约39%），这可能与全基因组扩增（WGA）等技术限制有关。总之，CTC不仅提供了观察MM克隆景观的无创窗口，还能捕获单点活检无法看到的空间分布亚克隆，从而增强克隆监测的分辨率，帮助我们理解肿瘤进化、进展和治疗耐药。
CTC检测与表征的技术与工具
CTC的检测与分离技术日益精确，其核心推动力是多参数流式细胞术和免疫磁珠分选富集方案的进步。目前最灵敏、可重复的定量方法是下一代流式细胞术（NGF）。该方法依赖于优化的八色抗体组合，结合批量裂解方案，能够获取大量细胞事件。NGF的检测限接近10-6，定量限低于5×10-6，相当于在107个细胞中检测出20个肿瘤浆细胞。
精确识别CTC需要根据表型标记物的异常表达模式，将其与残留的正常浆细胞区分开。这包括CD19、CD56、CD81、CD27、CD117等标记物的表达偏差，以及CD38和CD138的强表达。值得注意的是，这些标记物的表达水平在CTC和同一患者的骨髓浆细胞之间可能不同。
鉴定后，可通过结合免疫磁珠富集和高速细胞分选来分离有活性的CTC用于分子研究。常用方法是使用CD138偶联的磁珠进行阳性分选，富集大量血液中的浆细胞。随后，可根据免疫表型使用高速流式细胞分选仪进行分选。这些工作流程与核酸保存方案的兼容性，确保了可回收到足够质量的基因组DNA或RNA，用于下游的ULP-WGS、靶向深度测序、全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）或RNA测序。
分子分析方面，由于CTC的DNA和RNA量极少，通常需要全基因组扩增（WGA）或转录组扩增，这会引入覆盖偏差和技术噪音，需要仔细的生物信息学过滤。尽管如此，基因组学方法如CTC的ULP-WGS允许从有限材料中进行拷贝数分析和倍体评估。转录组学分析则可通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）等技术，以高分辨率解析CTC的细胞异质性。整合的DNA/RNA策略使得能够在同一细胞中联合评估基因组改变和转录程序。总而言之，虽然CTC的分子分析是可行且信息丰富的，但其应用目前仍主要停留在研究阶段，在进入常规临床应用前需要进一步的方法学标准化。
CTC在MM中的临床相关性
CTC已成为MM中一个相关的生物标志物，提供了一种可克服骨髓评估某些局限性的液体活检方法。近期欧洲专家共识（EHA-EMN）已认可CTC为MM的新兴生物标志物。在诊断时，利用CTC评估MM分子图谱是一个新兴领域。例如，MinimuMM测序技术结合CTC富集和低输入量WGS，成功实现了MM CTC的高分辨率基因组分析，仅用50个CTC就能进行全基因组拷贝数分析，并再现了配对骨髓浆细胞中的关键基因组特征，与标准的间期荧光原位杂交（FISH）结果高度一致。另一项研究开发的SWIFT-seq，是一种应用于CTC的单细胞RNA/BCR测序工作流程，不仅能进行可靠计数，还能推断细胞遗传学病变并评估肿瘤增殖和循环能力。
CTC定量作为诊断时的预后生物标志物
CTC的定量在诊断时展现出独立的预后价值。多项研究证实，诊断时外周血中CTC的存在与较差的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关。例如，在FORTE试验中，>0.07%的CTC阈值与较短的PFS和OS独立相关。在GEM2012MENOS65试验中，≥0.01%的阈值是OS的独立预测因子。PERSEUS试验则确定了0.175%的阈值，并将CTC-high与高危细胞遗传学异常（HRCA）结合，定义了超高危患者亚组。这些阈值因技术平台和患者群体而异，但普遍趋势是，即使低水平的CTC也具有预后意义，而高CTC负荷（如接近PCL的阈值）与极差的预后相关。
高CTC水平与不良临床特征和基因组复杂性相关，包括染色体碎裂、APOBEC突变特征以及增殖性转录组程序。单细胞分析表明，CTC高负荷反映了骨髓疾病固有的侵袭性、基因组复杂性和增殖活性增加，而非出现了独特的循环克隆。因此，CTC定量是一个可重复的独立预后标志物，其预后价值在不同技术和队列中一致，支持将其与细胞遗传学和MRD评估一同整合到临床风险模型中。
CTC在癌前病变和相关浆细胞疾病中的定量
CTC定量在整个浆细胞疾病谱系中都具有意义。在MGUS中，可在部分患者中检测到低水平的CTC，其存在与克隆竞争动态和进化中的基因组特征相关。在SMM中，即使极低水平的CTC（如0.015%）也与更短的无症状进展时间独立相关，其预测能力超越了传统的临床风险分层模型。在轻链（AL）型淀粉样变性中，初步报告也表明CTC可在一部分患者中检测到，并与不良临床特征相关。这些发现支持CTC定量有助于跨癌前病变和相关浆细胞疾病的风险分层，反映了生物学侵袭性的渐进连续体。
CTC检测用于MRD监测
微小残留病（MRD）监测已成为MM预后判断的基石，基于骨髓的MRD阴性是长期缓解的最强预测指标之一。然而，MM的空间异质性对单纯骨髓评估的敏感性提出了挑战。CTC分析为此提供了一个有前景的外周血补充评估手段。早期尝试使用等位基因特异性寡核苷酸定量PCR（ASO-qPCR）在移植前患者中检测CTC。而流式细胞术方法，特别是NGF，已成为更实用的选择。研究表明，治疗后可检测到的CTC与较短的PFS相关，即使在骨髓MRD阴性的患者中也是如此。这支持了CTC检测反映了潜在的生物学活性，而非仅仅是取样局限的观点。
BloodFlow研究是这一领域的重大进展，它采用磁珠富结合NGF的方法，实现了对CTC的高灵敏度检测（约2×10-6）。该研究发现，治疗后CTC的持续检测与显著缩短的PFS相关，即使在骨髓MRD阴性的患者中也是如此。这提示CTC可能提供与骨髓MRD评估互补的生物学信息。尽管如此，目前CTC检测在分析灵敏度、标准化阈值和前瞻性验证方面的局限性，使其尚不能临床替代基于骨髓的MRD检测。未来的研究需要与循环肿瘤DNA（cfDNA）、克隆型蛋白质谱和PET-CT功能成像等其他新兴MRD评估工具相结合，在更广阔的背景下进行评估。
临床前景与未来方向
CTC在MM中的临床应用涵盖两个互补领域：基于流式细胞术的免疫表型检测和基于基因组学方法的分子表征。基于流式细胞术的CTC计数已成为诊断时一个稳健且标准化的预后标志物，其预后影响是量化的：CTC水平升高与较差的PFS和OS独立相关，而低水平的CTC则可能识别预后良好的患者。纵向CTC监测提供了一种无创追踪疾病动态的方法。在BloodFlow研究中，治疗后持续的CTC检测与较差的预后相关，即使在达到骨髓MRD阴性的患者中也是如此。
同时，CTC的基因组学和转录组学分析是一个新兴但技术要求高的前沿领域。单细胞和超低输入测序显示，CTC在很大程度上反映了骨髓浆细胞的突变和克隆景观，同时偶尔能揭示与进展或耐药相关的额外亚克隆。然而，由于治疗期间CTC极其稀少以及低DNA输入的技术限制，使用CTC进行MRD检测仍然极具挑战性。
CTC分析必须在更广泛的液体活检框架内进行解读。循环cfDNA提供了肿瘤衍生核酸的系统性视图，而用于残留单克隆蛋白检测的质谱和功能成像（如PET-CT）提供了互补的功能性见解。将这些互补的液体活检方法整合到临床工作流程中，辅以持续的方法学标准化和前瞻性验证，可能为实现动态、实时的疾病监测铺平道路，从而弥合生物学与患者护理之间的鸿沟。
