《Journal of Genetics and Genomics》：In vivo epigenome editing reduces circulating lipids and attenuates atherosclerosis in mice
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动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的致病核心是高胆固醇血症，传统降脂疗法存在疗效持久性差、安全性存疑等问题。本研究开发CRISPRoff表观编辑平台，通过AAV或LNP递送实现Hmgcr或Pcsk9的肝脏特异性沉默，在野生型和ApoE-/-小鼠中均获得显著血脂降低和动脉粥样硬化斑块稳定效果。该技术为非基因组靶向的持久性脂代谢调控提供了新范式。
魏 Wang|张英杰|陈琳|卢元斌|何云杰|程辉|唐婷|李新怡|张佳怡|刘妍|王洋|孔玉璇|袁辉军
四川大学华西医院罕见病研究所，中国成都610041
摘要
动脉粥样硬化性心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因，高胆固醇血症是动脉粥样硬化形成的关键驱动因素。尽管目前的降脂疗法显著改善了循环中的脂质谱，但仍需要更持久、安全、更有效的脂质代谢控制策略。表观基因组编辑提供了一种有前景的方法，可以在不改变基础DNA序列的情况下长期抑制疾病相关基因。在这里，我们开发了通过腺相关病毒或脂质纳米颗粒递送的CRISPRoff平台，以在体内表观遗传学上沉默肝Hmgcr或Pcsk9。在C57BL/6J野生型和ApoE?/?小鼠中，CRISPRoff对这些目标进行了强烈且持久的抑制，导致循环中的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯显著降低。在ApoE?/?小鼠中，Pcsk9的表观遗传学沉默带来了明显的血管保护作用，包括肝脏和主动脉根部的脂质积累减少、坏死核心形成减少、巨噬细胞浸润减弱以及斑块稳定性提高。这些结果共同证明了基于CRISPRoff的表观基因组编辑能够稳定抑制临床相关目标，并改善动脉粥样硬化疾病的特征。这项工作为表观基因组修饰在心血管疾病中的更广泛应用奠定了基础。
引言
动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）仍然是全球发病率和死亡率的主要原因。高胆固醇血症是主要的致病因素，它促进了动脉内膜内的脂质沉积和慢性炎症（Herrington等人，2016；Ference等人，2017；Libby，2021；Liu等人，2022）。在过去的几十年中，通过药物调节脂质代谢，在管理ASCVD方面取得了实质性进展。关键策略包括抑制HMG-CoA还原酶（HMGCR）以限制肝脏胆固醇合成（Crisby等人，2001；Nicholls等人，2011；Banach和Surma，2023），通过NPC1L1抑制剂阻断肠道胆固醇转运（Strandberg等人，2024），以及使用单克隆抗体或siRNA抑制PCSK9以防止LDL受体（LDLR）降解（Roth和Davidson，2018；German和Shapiro，2020；Liu等人，2022）。抑制HMGCR和PCSK9所带来的显著降脂和心血管益处突显了它们的治疗价值。这些目标是经过基因验证的、对胆固醇稳态具有高影响的干预点。然而，临床应用受到患者反应异质性（Reiner，2014）、长期安全性不确定性（Ward等人，2019；Cannon，2022；Olmastroni等人，2024）、对慢性治疗方案的依从性差（Fang等人，2024）以及治疗成本高昂（Hernandez，2017；Smith等人，2021）的限制。这些挑战突显了通过单一或不频繁的干预措施实现持久脂质控制的必要性（Hooper等人，2024）。
基因疗法为脂质代谢的持续调节提供了一个有吸引力的框架（Chadwick等人，2018；He等人，2020；Zhao等人，2020）。利用碱基编辑介导的基因破坏（Komor等人，2016；Levy等人，2020），对PCSK9或ANGPTL3进行单次体内编辑已经实现了持续的脂质调节效果，标志着向“一次性的”血脂异常管理的范式转变（Hooper等人，2024；Laffin等人，2025）。尽管这些平台具有潜力，但它们也引发了重大的安全和伦理问题。主要问题包括不可逆的DNA修饰、双链断裂（DSBs）可能导致的基因组不稳定以及脱靶效应（Komor等人，2016；Tsai和Joung，2016；Conti和Di Micco，2018；Li等人，2020；Aussel等人，2025；Yang等人，2025）。基于CRISPR的表观基因组编辑工具作为一种有吸引力的替代方案出现，能够在不改变基础DNA序列的情况下稳定抑制基因表达（Stelzer等人，2015；Amabile等人，2016；Liu等人，2016）。其中，CRISPRoff通过将KRAB抑制因子与Dnmt3a-Dnmt3L复合体融合到催化失活的dCas9上，实现了体外精确且可遗传的转录沉默（Nunez等人，2021）。值得注意的是，这种抑制状态可以通过dCas9-TET去甲基化系统完全逆转（Nunez等人，2021；Lin等人，2025；Xu等人，2025）。可逆性、可编程性和潜在降低的基因毒性风险使CRISPRoff成为治疗由稳态失调驱动的代谢疾病的有希望的工具。
在这项工作中，我们评估了通过腺相关病毒（AAV）或脂质纳米颗粒（LNP）递送的CRISPRoff系统在体内持续抑制脂质调节基因以减轻血脂异常和动脉粥样硬化的有效性。我们在C57BL/6J野生型（WT）小鼠中靶向Hmgcr或Pcsk9以监测肝脏表达和脂质水平，并同时在ApoE?/?小鼠中沉默Pcsk9以评估动脉粥样硬化的进展。因此，我们的工作证明了可编程的表观遗传学沉默是一种持久且无基因毒性的治疗方式，为通过AAV或LNPs可接触的组织中的广泛应用铺平了道路。
实验片段
体外sgRNA筛选发现了有效的CRISPRoff介导的Hmgcr沉默引导序列
为了确定有效的Hmgcr表观遗传抑制引导序列，我们建立了一个对甲基化敏感的报告基因系（293T-HmgcrSnrpn-EGFP），并设计了九个针对典型CpG岛的sgRNAs（表S1）。CRISPRoff和单个sgRNAs的共同转染后，通过blasticidin富集，通过流式细胞术进行了定量抑制评估（Nunez等人，2021）。转染7天后，EGFP的抑制程度在46.7%到66.7%之间（图1A–1C）。
讨论
本研究证明了CRISPRoff介导的Hmgcr或Pcsk9表观遗传沉默是一种有效且持久的策略，可用于体内调节脂质代谢。单次系统给予AAV8-CRISPRoff靶向Hmgcr在WT小鼠中实现了对肝脏mRNA（约50%）和蛋白质（约36%）的强烈抑制，导致循环中的总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）显著降低。LDL-C的适度降低与HMGCR在胆固醇生物合成中的主要作用一致，而不是在脂蛋白代谢中的作用。
细胞培养、转染和流式细胞术
HEK293T和N2a细胞在含有10% FBS（Gibco）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（Gibco）的DMEM（Gibco）培养基中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。细胞至少传代3代后，接种到48孔板（Nest）中进行转染。CRISPRoff和sgRNA表达质粒按照制造商的说明使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）引入。转染48小时后，加入blasticidin（Beyotime）5天以富集未引用参考文献
Li和Dewey，2011；Liu等人，2022。
数据可用性
本研究中生成的原始RNA-seq和WGBS测序数据已存储在中国国家生物信息中心（CNCB）的Big Sub系统中，访问号为PRJCA059845，并在NCBI BioProject数据库中，访问号为PRJNA1423435。支持本研究结果的所有其他数据可在正文及其补充材料中找到。CRediT作者贡献声明
魏 Wang：撰写 - 审稿与编辑，撰写 - 原稿，可视化，验证，监督，方法学，研究，数据管理，概念化。张英杰：撰写 - 审稿与编辑，撰写 - 原稿，监督，方法学，研究，数据管理，概念化，项目管理。陈琳、卢元斌、何云杰、程辉、唐婷、李新怡、张佳怡、刘妍、王洋、孔玉璇：方法学，研究。袁辉军：撰写 -利益冲突
作者魏王、张英杰和袁辉军声明存在潜在的利益冲突：一项与开发用于高效评估DNA甲基化的细胞模型的载体相关的专利申请（申请编号2024101496987）目前正在审理中。其余作者声明没有相关的利益冲突。致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号82030030和82530036）和四川大学华西医院的1·3·5卓越学科项目的资助（编号ZYJC20002）。同时，我们也衷心感谢成都国家超级计算中心和华西医院信息中心提供的数据分析和存储资源以及技术支持。
