《Journal of Immunological Methods》：Evaluation of a canarypox- vectored recombinant vaccine expressing canine distemper virus H gene using multiplex real time RT-PCR
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犬瘟热病毒（CDV）疫苗的分子评估方法研究：采用多联实时RT-PCR技术分析15个疫苗批次（5个canarypox重组疫苗和10个MLV疫苗），发现MLV疫苗的Ct值与TCID50滴度呈显著负相关，而canarypox疫苗的Ct值范围更窄且无RNA排出。该方法为无法常规检测的重组疫苗提供了快速、灵敏的批次一致性评估和辅助质量控制手段。
Nermeen Gouda Shafik、Heba A. Khafagy、Amal Abd El Moneim Mohamed、Sara El Sawy Ahmed、Mohamed Samy Abousenna
埃及开罗中央兽医生物制品评估实验室，邮政信箱131，邮编11381
摘要
犬瘟热病毒（CDV）是一种高度传染性的病原体，影响家养和野生食肉动物，疫苗接种仍然是主要的控制策略。虽然改良活病毒（MLV）CDV疫苗通常通过基于感染力的检测方法进行评估，但复制缺陷的金丝雀痘载体重组疫苗无法使用传统的组织培养滴度法进行评估。本研究应用多重实时RT-PCR（多重RT-qPCR）检测方法，针对CDV血凝素（H）基因，对商业CDV疫苗批次进行了体外分子特性分析。为了保持生物学相关性而不推断感染力，使用TCID??特性明确的参考菌株进行分子定量。分析了15批商业疫苗——5批金丝雀痘载体疫苗和10批MLV疫苗。该检测方法表现出高线性（R2 = 0.998）、高扩增效率（约94%）以及在较宽动态范围内的灵敏检测。金丝雀痘载体疫苗的Ct值范围较窄（14.7–18.8），表明RNA信号强度的变异性较低，而MLV疫苗的Ct值变化较大，某些批次的RNA信号减弱。
在MLV疫苗中，Ct值与TCID??滴度呈强烈负相关，并与病毒中和滴度（VNT）相关，表明较高的RNA信号强度伴随着较高的感染力和更强的体液免疫反应。分别对MLV和金丝雀痘载体疫苗进行了相关性分析，以解释生物学机制的差异，所有关联都被解释为相关性而非因果关系。接种后排毒分析显示，MLV疫苗接种的动物体内有短暂的低水平疫苗RNA排出，而金丝雀痘载体疫苗未检测到排毒现象。总体而言，多重RT-qPCR提供了一种灵敏且可重复的分子方法，用于评估疫苗批次的一致性和质量控制。这种方法补充了现有的生物学检测方法，并为传统感染力测试不适用的情况提供了实用的体外替代方案。
引言
犬瘟热（CD）是一种由犬麻疹病毒（ formerly known as canine distemper virus, CDV）引起的犬类高度传染性病毒性疾病，该病毒属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）的麻疹病毒属（Morbillivirus）（Martinez-Gutierrez和Ruiz-Saenz，2016）。CDV感染多种家养和野生动物食肉动物，导致全身性感染，表现为呼吸道、胃肠道和神经系统症状，常伴有免疫抑制（Greene，2012；Martinez-Gutierrez和Ruiz-Saenz，2016）。由于其高传染性、严重的临床后果以及在未接种疫苗的犬群中可能引发疫情，CD仍然是全球兽医领域的主要关注点（Zacarias等，2016）。
疫苗接种是全球控制犬瘟热感染的关键（Squires等，2024）。最初的疫苗开发于20世纪20年代，并在20世纪中叶上市，包括血清基和灭活制剂，仅提供有限的保护。这促使了改良活疫苗或减毒CDV疫苗的发展，成为犬类免疫计划的主要手段（Appel，1978）。这些疫苗偶尔与接种后犬瘟热相关，首次在澳大利亚犬只中发现（Hartley，1974），随后在全球其他犬群中也观察到（Vandenberghe等，2021；Henna等，2024；R?tsep和Ojkic，2024）。同窝动物的发病情况表明，宿主遗传因素或可遗传的免疫缺陷可能增加易感性（Fairley等，2015；Pekkarinen等，2024a，Pekkarinen等，2024b）。某些疫苗株的残留毒力也被认为与罕见病例有关（Appel，1978）。
改良活病毒（MLV）疫苗历史上提供了强大的保护作用，至今仍被广泛使用。然而，对于某些物种（如水貂）的安全性存在担忧，因为它们有可能恢复毒力（Wilkes，2022；Rendon-Marin等，2024）。为了提高安全性和免疫原性，开发了重组疫苗。一个著名的例子是金丝雀痘病毒（CNPV）载体疫苗，该疫苗表达CDV血凝素（H）和融合（F）蛋白。这种疫苗在犬和雪貂中能引发强烈的保护性免疫，但在狐狸中的效果有限（Larson和Schultz，2007；Hidalgo-Hermoso等，2019）。为了进一步提高免疫原性和多功能性，正在探索CRISPR/Cas9基因组编辑等现代方法来构建优化的CNPV载体重组CDV疫苗。目前获许可的重组疫苗表达免疫优势的HA和F蛋白，不会在宿主细胞中产生传染性病毒，为传统MLV疫苗提供了安全有效的替代方案（Gong等，2020）。
在中央兽医生物制品评估实验室（CLEVB），传统上通过基于细胞培养的检测方法评估CDV改良活疫苗，包括TCID??滴度和间接免疫荧光，以及在血清阴性犬和雪貂中进行体内安全性和免疫原性测试，遵循如9C.F.R. §113.306（美国农业部，2024）等监管指南。这些方法虽然成熟且合规，但资源密集、技术要求高且耗时，可能在疫苗生产高峰期限制检测效率。
CNPV载体重组CDV疫苗的评估面临独特挑战。CNPV是一种禽类特异性病毒，不能在哺乳动物细胞（包括MDCK细胞）中产生传染性后代。因此，传统的感染力检测方法（如TCID??或斑块形成实验）不能用于这些疫苗。尽管如此，CNPV载体能够进入哺乳动物细胞并表达CDV H和F蛋白等转基因，但不产生传染性病毒。这一特性允许在体内诱导足够的抗原表达以产生保护性免疫，但阻止了使用传统细胞培养方法直接量化病毒复制（Pardo等，1997；Larson和Schultz，2007）。
为了解决这些限制，分子方法提供了实用的体外快速表征方案。多重实时RT-PCR（多重RT-qPCR）能够灵敏、可重复且高通量地量化疫苗来源的CDV H基因RNA，从而标准化地评估转基因基因组负荷和批次间一致性。在适当的生物学参考框架下解读这些分子结果，可以提供非基于感染力的支持性信息，补充传统的疫苗评估方法，而不是替代经典的效力或免疫原性检测（Sui等，2023）。
同时，我们的团队和合作者一直在开发和验证其他快速评估兽医疫苗的方法，包括侧向流诊断、定量分子检测和基于PCR的替代效力方法，旨在减少对长时间组织培养和体内检测的依赖，同时保持可靠的疫苗质量估计（Abousenna等，2024；Shafik等，2024；Abousenna等，2021；Abousenna等，2020a；Abousenna等，2020b）。这些方法已证明适用于多种兽医疫苗，包括犬细小病毒、口蹄疫、裂谷热和羊痘，并可整合到CNPV载体重组CDV疫苗的评估流程中。本研究的主要目的是将多重RT-qPCR应用于表达H基因的CNPV载体重组CDV疫苗的体外分子特性分析。该检测方法能够快速灵敏地量化疫苗来源的H基因RNA，提供关于转基因基因组负荷和批次间一致性的标准化信息。这种分子方法旨在补充而非替代传统的生物学和监管评估方法，并支持在体内评估之前的早期批次筛选。
从埃及开罗CLEVB的菌株库部门获得了许可的Rockborn参考CDV菌株，其认证感染力滴度为每0.1 mL 10? TCID??。该参考菌株专门用作针对CDV H基因的多重RT-qPCR检测的生物学定量对照，遵循先前描述的方法（Sui等，2023）。
将参考病毒在无RNase稀释液中制备十倍系列稀释液
使用Rockborn参考菌株的十倍系列稀释液生成了CDV H基因的标准曲线。Ct值与病毒感染力的对数（以log?? TCID??/mL表示）呈强线性关系，回归方程为y = ?0.2881× + 10.232，相关系数R2 = 0.998（图1）。回归曲线的斜率表明高扩增效率，出色的线性表明该检测方法具有可靠性
本研究应用多重RT-qPCR检测方法对CNPV载体重组CDV疫苗进行了分子特性分析，并将其性能与常规用于疫苗质量控制的感染力、血清学和排毒数据集进行了比较。虽然之前已有针对CDV结构基因的多重RT-qPCR检测方法的描述，但本工作强调了其在实际批次评估条件下的应用，特别是对于疫苗平台
本研究存在几个局限性。分子分析仅限于CDV H基因，这是基于免疫相关性和检测稳健性选择的；然而，这种方法未能捕获其他病毒成分，如F蛋白。尽管该检测针对H基因的保守区域，但使用单一菌株（Rockborn）作为校准标准可能会在不同遗传背景的CDV菌株（包括MLV和CNPV载体疫苗中使用的菌株）引入轻微的定量偏差。
本研究展示了多重RT-qPCR针对CDV H基因的实际应用，作为一种灵敏且可重复的分子方法，用于CNPV载体重组CDV疫苗的体外特性分析，而传统的基于感染力的检测方法不适用。通过使用Ct值作为RNA信号强度的相对指标，该检测方法能够在不推断感染力或生物学特性的情况下区分具有不同分子特征的疫苗批次
Nermeen Gouda Shafik：监督、研究。
Heba A. Khafagy：方法学、数据管理。
Amal Abd El Moneim Mohamed：方法学、数据管理。
Sara El Sawy Ahmed：验证、方法学、正式分析。
Mohamed Samy Abousenna：方法学、正式分析、数据管理、概念化。
Mohamed Samy Abousenna：撰写——审阅与编辑、初稿撰写。
