《LWT》：Spoilage potential of Bacillus isolates from preserved furu rou (sufu-braised streaky pork) prepared dish and their impact on volatile organic compounds during storage
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为解决预制腐乳肉在贮藏期间易受耐热芽孢污染而腐败的问题，本研究从4°C贮藏40天的腐乳肉中分离出具有高蛋白酶和脂肪酶活性的解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) JY-4和枯草芽孢杆菌(B. subtilis) JY-71。研究发现，JY-71可代谢产生大量含硫化合物和氮氧化物，导致腐臭；两种菌株会促进酯类和醇类等芳香化合物转化为醛类、酸类和肼类等异味特征化合物，从而揭示了特定芽孢杆菌在腐乳肉中的腐败行为，为制定有效质控策略提供了理论依据。
随着现代生活节奏的加快，方便快捷的预制菜日益融入人们的日常饮食。然而，从生产加工到摆上餐桌的整个供应链中，微生物污染是导致产品腐败变质的核心因素，其中形成耐热芽孢的芽孢杆菌尤其令人头疼。这类细菌的芽孢能在热加工中存活，一旦贮藏条件适宜便可萌发繁殖，成为导致产品劣变的特定腐败菌(SSOs)。它们分泌的酶会降解蛋白质和脂肪，导致产品质地软化、表面发粘、色泽变差，其代谢产生的异味化合物更会严重损害产品的风味。由腐乳（一种具有千年历史的传统发酵豆制品）作为核心调料烹制的腐乳肉，是源自“满汉全席”的经典菜肴，因其醇厚浓郁、肥而不腻的风味而广受欢迎。其制备工艺相对简单，便于实现标准化生产，且可通过冷藏或气调包装等方式长期保存，具有可观的发展价值和市场适应性。但腐乳肉营养丰富，也为芽孢杆菌的生长繁殖提供了有利环境，使其在贮藏期间面临腐败风险。尽管解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等因其较弱的致病性常被忽视，但它们对预制菜风味和品质的影响却少有报道。填补这一领域的研究空白，对于减少食物浪费、保障预制菜产品品质安全具有重要价值。为此，一项发表于《LWT》的研究，以腐乳肉为模型体系，旨在阐明耐热芽孢杆菌在由发酵调料和肉类组成的复杂基质中的腐败行为。
为开展此项研究，研究人员运用了几个关键技术方法。首先，他们从自然腐败的样品中分离优势菌株，并通过16S rRNA基因测序进行分子鉴定。其次，通过人工接种芽孢悬浮液到腐乳肉样品中，模拟了4°C和37°C两种实际贮藏环境。再者，研究综合利用了电子鼻(E-nose)和电子舌(E-tongue)对样品的整体气味和滋味特征进行快速、无损分析。最后，通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)对样品中的挥发性有机化合物(VOCs)进行定性和相对定量分析，从而在分子层面揭示风味物质的变化。
3.1. Identification of dominant bacteria in furu rou
研究人员从4°C贮藏40天的腐乳肉中分离出具有不同形态的菌落，并通过体外蛋白和脂肪水解实验评估其腐败潜力。结果显示，菌株JY-4和JY-71在蛋白酶和脂肪酶活性上均表现出显著优势。经16S rRNA基因序列分析和系统发育树构建，最终鉴定JY-4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，JY-71为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
3.2. Growth curves and in-situ enzyme activity of dominant bacteria
生长曲线显示，两种芽孢杆菌在37°C恒温培养下呈现典型的“S”型生长。在腐乳肉基质中，两种菌株的原位蛋白酶和脂肪酶活性随着培养时间迅速升高，并在菌株进入稳定期前后达到峰值，表明它们在腐乳肉的特定营养环境中具有显著的水解酶分泌活性。
3.3. Chemical analysis during storage of furu rou
在贮藏期间，研究人员监测了多项化学指标的变化。pH值的变化趋势复杂，在37°C贮藏后期，接种JY-71的样品pH显著下降。总挥发性盐基氮(TVB-N)是评价蛋白质分解程度的重要指标，在4°C贮藏4天和37°C贮藏6小时后，所有接种处理组的TVB-N值均超过了15 mg/100g的安全限值，其中JY-71组的TVB-N值最高，表明其蛋白质降解能力更强。硫代巴比妥酸反应物(TBARS)值用于评估脂肪氧化程度，在两种贮藏温度下，接种处理组的TBARS值均显著高于对照组，表明芽孢杆菌的活动加剧了脂肪氧化。
3.4. Effect of Bacillus on the flavor of furu rou during storage
3.4.1. Electronic nose data analysis
电子鼻雷达图和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)表明，不同处理组的样品气味特征存在差异。特别是JY-71-37组（37°C贮藏的JY-71接种组）对检测硫化物(W1W传感器)和氮氧化物(W5S传感器)的传感器响应值显著增强，这与该菌株在高温下分泌高活性蛋白酶，促进含硫挥发性化合物和氮氧化物的形成有关，这些物质通常与腐臭气味相关。
3.4.2. Electronic tongue analysis
电子舌分析显示，贮藏后处理组出现了苦味回味和涩味回味，且样品的丰富度（鲜味回味）显著下降。主成分分析(PCA)将不同处理组的滋味特征有效区分，其中JY-71-4组的滋味轮廓与其他组差异显著，表明即使在4°C低温下，该菌株仍能通过分泌酶类影响产品滋味。
3.4.3. Changes in VOCs
通过GC-MS共鉴定出98种VOCs。火山图分析揭示了贮藏期间挥发性成分的动态变化。在4°C贮藏早期，醛类（如己醛）含量上调，而酯类含量下调；贮藏后期，酸类（如反-13-十八碳烯酸）上调，醇类下调。在37°C贮藏条件下，肼类化合物（如甲基肼、5-糠基乙内酰脲）含量显著增加。此外，在两种贮藏温度下，均检测到胺类/酰胺类化合物（如2-(氮丙啶-1-基)乙胺）在JY-71接种组中显著上调。OPLS-DA和变量重要性投影(VIP)分析进一步筛选出在不同贮藏条件下的关键差异挥发性化合物。
3.4.4. Pearson correlation analysis between key VOCs and taste properties
皮尔逊相关性分析和相对气味活度值(ROAV)评估将关键VOCs与滋味属性关联起来。例如，丁二醇与酸味呈极显著正相关，与苦味呈显著负相关；乙酰甲基原醇与涩味回味呈极显著正相关。这些具有显著相关性的VOCs其ROAV值均大于1，说明它们在实验浓度下很可能被感知，为其与滋味劣变的关联提供了感官-化学依据。
研究结论与意义
本研究系统评估了芽孢杆菌在体外及腐乳肉基质中的腐败潜力，主要得出以下结论：首先，从腐败腐乳肉中分离出的优势菌株JY-4和JY-71被鉴定为解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，两者均表现出较高的胞外蛋白酶和脂肪酶活性。其次，这些菌株能通过分泌蛋白酶和脂肪酶有效催化蛋白质和脂肪的降解，从而显著加速腐乳肉的腐败进程。再者，枯草芽孢杆菌JY-71在腐乳肉中定殖后，能大量产生含硫挥发性化合物，并显著增强产品的苦味回味和涩味回味。最后，芽孢杆菌的代谢活动显著影响了腐乳肉中VOCs的动态演变，促进了醛类、酸类和肼类等异味物质的生成。
这项研究通过整合微生物学分析、酶活性评估和挥发性风味物质剖析（GC-MS、电子鼻、电子舌），更全面地理解了腐乳肉中与腐败相关的风味劣变过程，阐明了特定腐败微生物在此过程中的作用。研究成果为针对解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌这类耐热芽孢腐败菌制定精准的抗菌策略提供了直接的理论依据，例如优化热加工条件、应用超高压处理、或使用ε-聚赖氨酸、纳米乳化香茅油等天然抗菌剂，甚至可以利用腐乳自身发酵产生的有机酸和抗菌肽进行生物防治。这有助于改善预制菜肴的保鲜技术，减少食物浪费，对于保障产品食用安全、推动预制菜产业的可持续发展具有重要意义。当然，研究也存在局限性，例如未采用不依赖于培养的方法分析完整的腐败菌群生态，对酶与底物相互作用的分子机制、VOCs转化的具体途径尚不清楚，以及针对芽孢的有效控制方法仍需进一步探索。这些都将为未来该领域的深入研究指明方向。
