《BMC Methods》：Epigenome editing strategies: technological progress and in vivo applications
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本综述系统梳理了表现基因组编辑技术的最新进展，从基本原理（DNA序列结合模块与效应模块组合）到效率提升策略（如VPR、SAM、SunTag、CRISPRoff、DropCRISPRa），并重点探讨了其体内应用潜力。文章指出，该技术通过精确操控特定基因组区域的表观遗传修饰（如DNA甲基化、组蛋白修饰），实现对基因表达的定向调控，为理解表观遗传在发育、疾病（如癌症、印记疾病、神经退行性疾病）中的作用提供了强大工具，并展现出广阔的治疗前景。
引言：超越基因组编辑的新前沿
基因组编辑技术实现了对DNA序列的精准修改，而表现基因组编辑则更进一步，旨在操控不改变DNA序列本身、却能调控基因活性的表观遗传修饰。这包括DNA甲基化和多种组蛋白修饰（如甲基化、乙酰化）。越来越多的证据表明，表观基因组在发育、分化及疾病（如癌症、生活方式相关疾病）中扮演关键角色。因此，能够定点操控特定区域的表现基因组，不仅有助于解析其生物学功能，更为一系列疾病的治疗干预带来了全新可能。鉴于其日益增长的重要性，表现基因组编辑正成为基础与医学研究的核心工具。
表现基因组编辑如何运作？
表现基因组编辑技术的基本框架是将一个“DNA序列结合模块”与一个“表现基因组修饰酶（效应模块）”相连接。
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DNA序列结合模块：目前主要的基因组编辑技术，如锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas9系统，均可作为DNA结合模块用于表现基因组编辑。其中，CRISPR/Cas9系统因其设计简便、灵活性高而应用最广。特别是失去切割活性的“死亡”Cas9（dCas9）突变体的出现，极大地拓展了其在表现基因组编辑等领域的应用。此外，Cas9的其他同源蛋白（如dSaCas9、CjCas9等）因其更小的尺寸和不同的PAM序列识别特性，为体内递送和靶点选择提供了更多可能。
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效应模块：多种酶可作为效应模块，对靶点区域的表观遗传标记进行写入或擦除。例如，DNA甲基转移酶（DNMT，如DNMT3A）可催化DNA甲基化，通常导致基因沉默；Ten-eleven translocation（TET）酶则促进DNA去甲基化，激活基因表达。组蛋白修饰酶的种类更为多样，包括组蛋白乙酰转移酶（HAT）、去乙酰化酶（HDAC）、甲基转移酶（如催化H3K4me3、H3K27me3的酶）等，分别对应基因的激活或抑制。此外，转录激活因子（如VP64）或抑制因子（如KRAB结构域）也可作为效应模块，通过招募内源性共调控因子间接引起表观遗传变化，从而广泛调控基因表达。
提升表现基因组编辑效率
早期的系统是直接将dCas9与效应酶融合，但效率有时不足。为提高效率，新的策略被开发出来，核心是募集多个效应模块或组合多种表观遗传修饰。
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VPR系统：将三种转录激活结构域（VP64, p65, Rta）融合到dCas9上，产生比单一VP64更强的激活效果。
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SAM系统：利用MS2噬菌体衣壳蛋白（MCP）与特定RNA发夹结构的相互作用，在sgRNA上设计发夹来募集MCP-p65-HSF1融合蛋白，与dCas9-VP64协同实现强力转录激活。
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SunTag系统：将dCas9与多个GCN4表位串联，利用可结合GCN4的单链抗体（scFv）募集效应模块（如scFv-VP64）。通过优化GCN4重复间距，该系统也能高效募集scFv-TET1催化域进行DNA去甲基化。
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CRISPRoff系统：将dCas9与DNA甲基转移酶（Dnmt3A, Dnmt3L）效应域及KRAB抑制结构域融合，可建立持久的基因沉默。该系统能在目标基因启动子区建立DNA甲基化和抑制性组蛋白修饰，且这种沉默状态可在细胞分裂中遗传，实现了“一击即走”的长期沉默效果。
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DropCRISPRa系统：该系统将CRISPR-SunTag与具有内在无序区（IDR）的FET蛋白（如Fus）及转录激活结构域结合，利用液-液相分离（LLPS）在靶位点形成转录凝聚体，通过局部富集转录因子和表观遗传修饰因子，显著提升基因激活效率。
此外，化学诱导和光遗传学调控系统的开发，为表现基因组编辑提供了时间维度上的精确控制手段。
体内表现基因组编辑的应用
表现基因组受环境影响，其异常与多种疾病相关。由于表观遗传修饰是可逆的，操纵表现基因组具有治疗疾病的潜力。与造成DNA永久性改变的传统基因编辑相比，表现基因组编辑不引起DNA断裂或突变，被认为更安全。
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构建疾病模型小鼠：利用表现基因组编辑技术，研究人员已成功构建了如Silver-Russell综合征（通过靶向去甲基化H19差异甲基化区域）等表观遗传疾病的小鼠模型。这些模型动物表现出与人类疾病相似的症状，为研究疾病机制和筛选疗法提供了宝贵工具。
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体内表现基因组编辑治疗：该技术能够上调整因单倍剂量不足而表达不足的基因，或沉默显性突变基因、异常印记基因等，在治疗神经疾病（如亨廷顿病、Rett综合征、天使综合征、朊病毒病）、代谢性疾病（如高胆固醇血症）、癌症等方面展现出广阔前景。例如，利用锌指蛋白（ZFP）或转录激活因子样效应物（TALE）融合KRAB或DNA甲基转移酶构建的编辑器，通过腺相关病毒（AAV）或脂质纳米颗粒（LNP）递送，已在动物模型中实现了对靶基因（如PCSK9、亨廷顿蛋白突变体、tau蛋白）的长期、有效沉默，并缓解了疾病表型。其中，像CHARM这样具有自沉默功能的紧凑型编辑器，进一步提高了治疗的安全性和持久性。
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等位基因特异性表现基因组编辑：利用致病等位基因与正常等位基因之间的单核苷酸多态性（SNP）差异，可以设计只靶向突变等位基因的编辑系统，实现选择性沉默，这在治疗由显性突变引起的疾病（如亨廷顿病）时尤为重要，可以保护正常等位基因的功能。
挑战与展望
尽管前景光明，表现基因组编辑走向临床应用仍面临挑战。首要问题是编辑效果的持久性和稳定性，这需要优化编辑系统以实现稳定的“一击即走”效果，避免长期表达带来的免疫原性和脱靶风险。其次，递送技术是关键瓶颈，需要开发能够高效、特异靶向目标器官（尤其是大脑、肌肉等）的递送载体，如改造后的AAV血清型或具有器官趋向性的LNP。此外，CRISPR系统可能存在的预存免疫也是需要考虑的问题。
未来，随着对表观遗传编码理解的深化、更高效紧凑编辑工具的发现（如基于IscB、TnpB的编辑器），以及人工智能辅助的蛋白质设计（如深度学习设计锌指蛋白）和递送技术的突破，表现基因组编辑有望成为解析生命现象基本规律和对抗多种疾病的革命性利器。它不仅将深化我们对发育、分化及疾病中表观遗传调控机制的认识，更可能为目前难以治愈的遗传病、慢性病和年龄相关疾病带来全新的治疗范式。
