《Cellular Oncology》：Next-generation neoantigen mRNA vaccines: Immuno-engineering strategies for precision cancer immunotherapy
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这篇综述系统性阐述了下一代新生抗原mRNA疫苗（neoantigen mRNA vaccines）的技术演进与免疫工程策略。文章从抗原发现、mRNA设计、递送平台到临床转化，全面剖析了肿瘤特异性抗原（TSA）、肿瘤相关抗原（TAA）、共享新生抗原（shared neoantigen）及“现货型”（off-the-shelf）疫苗等不同策略的优劣与挑战，并指出与免疫检查点阻断（ICB）等疗法联合是近期的成功关键。全文整合了分子工程、免疫校准、制造可扩展性等多维度进展，为精准癌症免疫治疗提供了清晰的框架性展望。
下一代新生抗原mRNA疫苗：免疫工程策略推动精准癌症免疫治疗
引言
新生抗原mRNA疫苗已从实验性平台迅速转变为前景广阔的临床免疫疗法。通过编码肿瘤特异性突变，这些疫苗能够引导细胞毒性T细胞靶向正常组织中不存在的抗原，代表了精准肿瘤学的重大进步。mRNA疫苗设计主要依据三类抗原：肿瘤特异性抗原（TSA）、肿瘤相关抗原（TAA）和新生抗原。这引导出四大mRNA疫苗策略：个性化TSA疫苗、TAA平台、整合两者的混合构建体，以及针对复发性致癌突变的共享新生抗原“现货型”疫苗。抗原表位预测算法、测序技术和免疫肽组学的进步加速了抗原发现，而mRNA工程（包括核苷酸修饰、非翻译区优化和脂质纳米粒递送）的改进则增强了转录本稳定性和免疫激活。
新生抗原mRNA疫苗发展的技术里程碑
在2012年之前，mRNA癌症疫苗研究主要局限于临床前阶段。2012年引入的化学优化mRNA构建体显著提高了转录本稳定性和翻译效率，同时限制了不必要的先天免疫感应，为临床级mRNA疫苗奠定了技术基础。2014年至2015年间，全外显子组测序、RNA测序和免疫肽组学的整合彻底改变了抗原发现。2016年之后，早期临床研究表明个性化mRNA疫苗能够在患者中诱导可测量的CD8+和CD4+T细胞反应，但长达6-8周的制造周期等现实限制催生了向半个性化和共享平台的战略转变。
随后的开发工作集中于复发性TAA和源自常见致癌突变（如KRAS和TERT）以及融合衍生TSA（包括BCR-ABL和EWS-FLI1）的共享新生抗原。这些靶点支持更标准化的制造、减少生产延迟，并便于“现货型”部署。与此同时，脂质纳米粒技术、热稳定和冻干制剂以及替代给药途径的进步改善了生物分布、储存灵活性和全球可及性。这些里程碑共同说明了新生抗原mRNA疫苗如何从受不稳定性和有限靶向工具限制的实验性构建体，演变为由先进测序、预测免疫学和可扩展制造基础设施支持的集成化、临床导向平台。
替代性新生抗原mRNA疫苗策略
肿瘤特异性抗原mRNA疫苗接种
TSA是一类具有生物学优势的新生抗原，它们仅存在于恶性细胞中，在正常组织中不存在。其肿瘤限制性表达使其能够被识别为“非我”，从而允许高亲和力的细胞毒性T淋巴细胞反应，而不受通常限制TAA导向免疫的中枢耐受约束。这些抗原源自多种基因组改变，包括单核苷酸变异、插入缺失、基因融合、内含子保留和异常剪接。免疫肽组学分析通过识别来自非经典翻译事件、替代阅读框和非常规转录本的神秘肽段，进一步扩展了这一领域。TSA的识别得益于新一代测序和计算流程的进步，但计算机预测仍不完美，通常需要患者来源的T细胞进行验证，这对安全性和有效性都至关重要。
TSA mRNA疫苗的临床转化已证明这些生物学原理可以操作化。例如，在切除的胰腺导管腺癌中评估的自体疫苗能够在大约一半的治疗患者中诱导新生抗原特异性T细胞反应，且应答者表现出比无应答者更长的无复发生存期。尽管前景广阔，但个性化和制造流程耗时长、免疫压力可能导致抗原丢失等挑战依然存在。展望未来，整合患者特异性和共享TSA的模块化疫苗架构旨在平衡个性化与可制造性。与检查点抑制剂、I型干扰素激动剂等联合策略正被越来越多地探索，以增强疗效并防止免疫逃逸。实时循环肿瘤DNA监测提供了额外的适应性，能够在治疗期间动态追踪克隆演化并潜在优化疫苗组成。
肿瘤相关抗原mRNA疫苗接种
TAA的特征是在恶性细胞中异常表达、过表达、突变或发生改变的翻译后修饰，而在正常成人组织中表达有限。与TSA不同，TAA是自身来源的蛋白质，因此存在于外周耐受的范围内。然而，它们在多种肿瘤类型中的复发性表达支持了更广泛的临床适用性和更标准化的制造策略。常见的TAA包括CEA、HER2、WT1和MUC1。肿瘤特异性糖基化变化（如在腺癌中观察到的MUC1低糖基化形式）会暴露通常隐藏的肽段核心，并产生免疫学上可靶向的表位。
TAA mRNA疫苗的临床转化表明，共享抗原平台可以产生可测量的免疫反应。例如，编码多种黑色素瘤相关TAA的BNT111在晚期黑色素瘤中显示出早期的临床活性。临床前研究将肿瘤来源的囊泡平台与免疫检查点阻断相结合，进一步说明了TAA导向疫苗在小鼠模型中增强细胞因子产生和T细胞活化的能力。混合策略进一步扩展了这一概念。例如，mRNA-4157平台整合了患者特异性新生抗原和共享TAA，从而在个性化和可制造性之间取得平衡。在KEYNOTE-942试验中，与帕博利珠单抗的联合疗法显著改善了高风险切除黑色素瘤患者的无复发生存期并降低了远处转移风险。
尽管取得了这些进展，TAA导向疫苗仍面临固有的生物学挑战。由于TAA来源于自身蛋白，免疫优势等级和耐受机制可能会限制反应的强度。抗原丢失、表位呈递减少以及抗原加工途径缺陷进一步导致免疫逃逸。因此，越来越多地采用多表位配方和合理的表位优先排序来扩大免疫靶向范围并降低对单一抗原丢失的脆弱性。与检查点阻断的组合策略在临床前显示出疗效。同时，优化的脂质纳米粒平台增强了树突状细胞转染和抗原表达，从而提高了体内免疫原性。
共享新生抗原mRNA疫苗接种
共享新生抗原源自复发的体细胞驱动突变，这些突变在正常基因组中不存在，但在患者亚群中保守。与TAA不同，它们具有肿瘤特异性并避免中枢耐受，同时又与完全个性化的TSA不同，因其具有跨患者的复发性。这种双重特性——特异性与可扩展性相结合——将共享新生抗原定位为“现货型”mRNA疫苗开发的强力候选者。许多共享新生抗原源自致癌热点突变。例如，KRASG12C/D变体常见于胰腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌，可产生由特定HLA等位基因呈递的免疫原性表位。同样，复发的TERT启动子突变产生的抗原表位广泛存在于胶质母细胞瘤、黑色素瘤和膀胱癌中，支持更广泛的人群水平靶向。
临床前数据支持了这种方法的免疫原性。编码KRASG12D的mRNA构建体在小鼠模型中引发了强烈的CD8+T细胞反应和肿瘤消退，从而推动了KRAS靶向疫苗在转移性胰腺癌中的早期临床评估。然而，共享新生抗原的识别和优先排序仍然具有技术挑战性。预测算法经常高估肽-HLA结合亲和力，需要进行离体验证以确认真正的免疫原性。肿瘤也可能通过抗原编辑或通路适应来逃避免疫压力，这强调了同时靶向多个复发性突变的多表位构建体的重要性。因此，新兴策略强调模块化疫苗库，纳入跨肿瘤类型的常见驱动突变。
混合新生抗原mRNA疫苗接种
混合mRNA疫苗平台旨在将个性化TSA与复发性TAA或共享新生抗原整合到单个构建体中，从而将精准性与可扩展性结合起来。该策略认为，同时靶向克隆性、亚克隆性和共享的决定簇可能使肿瘤免疫获益。通过扩大抗原覆盖范围，混合构建体旨在增强免疫广度，降低抗原逃逸的可能性，并适应患者间的异质性。
这一概念的临床转化已证明其可行性。编码患者特异性突变以及共享抗原的平台在黑色素瘤中引发了多功能的CD8+和CD4+T细胞反应，特别是与抗PD-1疗法联合使用时，并与高风险环境中的改善的无复发生存结果相关。混合方法也受到生物学考虑的驱动。肿瘤在免疫压力下进化，靶向单一抗原类别可能导致抗原阴性克隆的选择性生长。将突变衍生的表位与复发性或通路相关抗原结合，增加了表位多样性，并促进了更广泛的T细胞库的募集。临床前证据表明，多抗原mRNA构建体可以实现比单靶点疫苗更持久的肿瘤控制，这与降低对免疫编辑的脆弱性一致。除了经典的突变和过表达衍生的靶点，混合平台还可以整合通过免疫肽组学和转录组谱分析鉴定的非常规肿瘤特异性表位。mRNA构建体的灵活性允许快速调整表位组成，同时保持标准化的制造流程。混合疫苗接种的另一个优势是动态适应性。连续肿瘤测序或循环肿瘤DNA监测能够实时评估克隆演化，从而允许在治疗期间优化抗原选择。
“现货型”新生抗原mRNA疫苗接种
“现货型”mRNA疫苗代表了新生抗原免疫疗法最具可扩展性的延伸，优先考虑标准化制造和快速部署，而非个性化定制。虽然共享新生抗原策略侧重于定义患者亚群内的复发驱动突变，但“现货型”平台旨在即时临床可用，通常根据人群中的常见致癌改变和HLA分布模式进行分层。复发突变，如KRAS密码子12变体和TERT启动子改变，由于它们在结直肠癌、胰腺癌、肺癌和胶质母细胞瘤中的普遍性，在此背景下特别具有吸引力。与需要连续测序和定制合成的个性化构建体不同，这些疫苗可以批量生产、储存和立即施用。
早期临床研究提供了免疫原性的证据。例如，GRT-C901/GRT-R902等“现货型”构建体在转移性实体瘤患者亚群中表现出可接受的安全性特征和可测量的免疫激活，包括诱导CD8+T细胞反应和循环肿瘤DNA减少。然而，这种方法面临独特的生物学限制。HLA多态性可能限制表位呈递，限制了普遍适用性，而肿瘤异质性可能导致患者间抗原表达的可变性。这些因素会削弱T细胞启动并降低治疗的一致性。为了解决这些限制，当前的开发工作强调多表位有效载荷，纳入根据人群水平HLA频率分层的频繁发生的驱动突变，以最大化覆盖范围。与检查点阻断和其他免疫调节策略的联合可能进一步增强反应的持久性。总而言之，“现货型”新生抗原疫苗接种代表了一种以人群为导向的策略，它利用标准化生产和快速可用性。虽然免疫遗传变异性仍然是一个挑战，但抗原选择、制剂稳定性和联合范式的持续改进可能使基于mRNA的癌症免疫治疗获得更广泛和更公平的可及性。
新生抗原mRNA疫苗的分子与结构优化
序列工程
有效的新生抗原mRNA疫苗开发始于序列工程，其根据每种抗原类别的生物学特性定制编码的转录本。TSA、TAA、混合构建体以及共享或“现货型”抗原在表达水平、免疫原性潜力和免疫耐受风险方面存在显著差异。这些差异影响着密码子优化策略、核苷酸修饰选择和调控序列设计。因此，序列工程旨在最大化抗原表达和免疫原性，同时保持转录本稳定性并避免过度的先天免疫激活。
对于TSA，主要目标是在确保高效蛋白质翻译的同时，保留包含突变的表位。由于许多新生抗原源自嵌入在正常蛋白质序列中的单核苷酸变异，密码子优化必须在调整其他密码子以提高翻译效率的同时，保持突变残基和周围的表位环境。相比之下，TAA构建体通常编码更长或全长的蛋白质，例如WT1或MUC1，这些可能容易形成广泛的RNA二级结构。为了减轻这种影响，序列设计通常包含适中的GC含量，这减少了稳定的RNA折叠并提高了核糖体可及性，从而增强了抗原呈递细胞中的翻译效率。
除了密码子选择，核苷修饰是序列工程的核心组成部分。修饰的核苷可以提高转录本稳定性、增强翻译输出并调节先天免疫感应。其中，N1-甲基-假尿嘧啶因其能减少先天免疫受体识别同时保持高翻译效率而被广泛用于实验性mRNA疫苗平台。该修饰已被纳入多个新生抗原疫苗平台中。不同的抗原类别可能需要不同的核苷修饰策略。在许多基于TAA的构建体中，使用假尿嘧啶或5-甲氧基尿嘧啶以维持有效翻译，同时保留支持抗原呈递和T细胞启动所需的适度免疫刺激水平。对于共享或“现货型”疫苗，N1-甲基-假尿嘧啶通常是首选，因为它最大限度地减少了不必要的炎症，同时允许强大的蛋白质产生，这对于驱动针对保守但可能弱免疫原性表位的反应至关重要。
非翻译区工程是优化mRNA稳定性和翻译的另一个关键层面。源自人球蛋白基因的UTR，特别是来自β-球蛋白和α-球蛋白的UTR，因能增强mRNA稳定性和翻译效率而被广泛采用。这些UTR减少了核酸酶降解，并促进核糖体的有效结合和扫描。5‘UTR的优化旨在具有最小二级结构的适度长度，以促进核糖体加载，而3’UTR则包含稳定元件，例如来自珠蛋白或其他高表达基因的序列，以延长mRNA的半衰期。多聚腺苷酸尾的长度和均匀性对mRNA稳定性、核输出和翻译至关重要，临床级构建体通常包含100-150个腺苷的尾。UTR的设计可能需要针对特定的抗原类别和靶细胞类型进行定制。例如，旨在在树突状细胞中强烈表达的疫苗可能会使用含有特定基序的UTR，这些基序可增强先天免疫传感和共刺激分子上调，从而增强T细胞启动。相反，旨在在多种细胞类型（包括肿瘤细胞）中表达的疗法可能会使用更普遍的UTR，以最大限度地提高跨组织的蛋白质产量。
结构设计与抗原工程
新生抗原mRNA疫苗的结构设计侧重于抗原编码区的组织，以优化免疫原性、表位呈递和制造可行性。设计选择在很大程度上取决于抗原类别和疫苗策略。对于个性化TSA疫苗，常见的方法是串联表位设计，将多个预测的新生抗原表位连接成一个单一的多肽序列。每个表位通常被蛋白酶体切割位点或柔性连接子隔开，以确保适当的细胞内加工和MHC呈递。这种串联方法允许在单个mRNA分子中递送多个表位，增加了引发广泛T细胞反应的可能性，并降低了因抗原丢失而免疫逃逸的风险。表位的选择和排序可以优化，以增强免疫原性并避免显性表位抑制对次要表位的反应。
对于TAA疫苗，编码序列通常包含全长或截短的蛋白质结构域，旨在呈递多个HLA限制性表位。设计可能需要包括信号肽以引导蛋白质进入分泌途径或内质网，从而增强MHC I类和II类呈递。在某些情况下，抗原与免疫刺激结构域（如 toll样受体激动剂或细胞因子）融合，以创建自佐剂疫苗，在抗原呈递部位局部增强免疫激活。共享新生抗原疫苗通常采用模块化设计，其中包含针对特定患者群体中常见驱动突变的定义表位库。这些构建体可以设计为多顺反子mRNA，从单个转录本表达多个独立抗原，或者设计为包含共享表位和用于添加患者特异性表位的“空位”的单一多肽，从而实现一定程度的个性化，同时保持可制造性。
“现货型”疫苗通常采用最标准化的设计，通常编码有限数量的定义明确的共享抗原。结构可能包括增强蛋白质稳定性或免疫原性的元素，例如泛素标签以靶向蛋白酶体降解，或融合到病毒衍生的T辅助表位以增强CD4+T细胞帮助。对于所有抗原类别，mRNA的物理化学特性，如GC含量和二级结构，都需要进行优化以确保高效的体外转录、纯化和封装到递送载体中。
递送平台与配方
有效的递送对于mRNA疫苗的成功至关重要，因为它保护脆弱的mRNA免于降解，促进细胞摄取，并增强免疫反应。脂质纳米粒是目前mRNA疫苗临床开发中最成熟和广泛使用的递送平台。LNP通常由四种成分组成：可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质。可电离脂质在酸性pH下带正电，与带负电的mRNA复合，并在内体pH下带正电，促进内体逃逸。胆固醇增加膜稳定性，辅助磷脂支持脂质双层结构，聚乙二醇化脂质减少调理作用并延长循环时间。LNP配方经过优化，可实现高效的树突状细胞和巨噬细胞靶向，这是启动强大T细胞反应的关键。
除了传统的LNP，新型递送系统正在探索中，以进一步提高效力、靶向性和安全性。这些包括聚合物纳米颗粒、脂质体、外泌体模拟囊泡和基于肽的载体。一些平台经过工程改造，以特异性靶向抗原呈递细胞或淋巴器官，从而增强免疫启动并减少脱靶效应。其他方法探索了替代给药途径，例如皮内、肌肉内、鼻内或口服给药，以引发粘膜免疫或改善患者依从性。配方的物理化学性质，如粒径、表面电荷和脂质组成，会显著影响生物分布、细胞摄取和免疫原性。因此，递送平台的设计通常针对特定的抗原类别和疫苗策略进行定制。例如，旨在引发强烈细胞免疫的TSA疫苗可能需要优先靶向交叉呈递树突状细胞的LNP配方。相反，旨在引发抗体反应的TAA疫苗可能受益于增强B细胞滤泡靶向的配方。
制剂稳定性和储存条件是临床转化的关键考虑因素。传统的mRNA-LNP制剂需要深度冷冻储存，这限制了在资源有限环境中的分发。正在开发新的配方策略以提高稳定性，例如冻干、喷雾干燥和室温稳定配方。这些进步旨在延长保质期，简化物流，并实现全球可及性。
