KDM3A催化组蛋白H3K9乙酰化羟化：一种连接缺氧感应与表观遗传调控的新型翻译后修饰

《Nature Chemistry》：KDM3A catalyses the oxidation of acetyl-lysine to hydroxyacetyl-lysine on histone H3K9

研究人员为了探索组蛋白修饰在转录调控与细胞应答缺氧中的新机制，筛选了JmjC组蛋白去甲基酶KDM3A的底物，意外发现其可催化组蛋白H3K9ac的羟化反应，生成稳定的H3K9acOH修饰。该研究揭示了KDM3A作为一种双功能酶，不仅可去甲基化H3K9me2/1，还能将乙酰化修饰进一步氧化，建立了O2依赖的组蛋白乙酰化与JmjC酶催化之间的直接联系，为缺氧相关疾病（如癌症）的表观遗传调控提供了新视角。

　　

在真核生物中，组蛋白的翻译后修饰（Post-translational modifications, PTMs）如同“化学标签”，精细调控着基因的转录活性，从而影响细胞命运、发育与疾病进程。其中，组蛋白赖氨酸的乙酰化（Kac）和甲基化（Kme）是最经典且研究最深入的修饰之一。通常，H3K9乙酰化与活跃转录相关，而H3K9的二甲基化和三甲基化则与基因沉默相关，二者之间存在功能上的拮抗。这些修饰的动态平衡由特定的“书写”（如组蛋白乙酰转移酶HATs、甲基转移酶KMTs）和“擦除”酶（如组蛋白去乙酰化酶HDACs、去甲基化酶KDMs）共同维持。有趣的是，有一类名为JmjC结构域组蛋白去甲基酶（JmjC-KDMs）的“擦除”酶，其催化活性严格依赖于氧气（O₂）和2-酮戊二酸（2OG），这与细胞感应氧气浓度的核心通路——缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor, HIF）通路中的关键酶（如FIH和PHDs）特性相似。这暗示了表观遗传调控与细胞感知环境氧分压之间可能存在更直接、更深刻的联系。然而，这种联系的具体分子形式是什么？JmjC-KDMs除了已知的去甲基化功能外，是否还能催化其他类型的、更稳定的氧化修饰，从而更持久地影响染色质状态和基因表达？这些都是领域内悬而未决的问题。

为了探索这些可能性，一支由Suzanne Ackloo、Jolanta Bonnici、Matthias Bütikofer、Lukas K. Frei、Tadashi Hondo、Jianqiang Liu、Keqin Kathy Li、Alexander Lemak、Mohan Babu、Brian Raught、Natalie G. Ahn、Cheryl H. Arrowsmith、Raymond J. K. Hui、Akane Kawamura、Junko Oishi、Tetsuya Handa、Masayuki Oda、Hiroyuki Kato、Yoshitaka Hippo、Yoshimasa Nakamura、Takashi Tokino、Hiroshi Kimura、Yutaka Suzuki、Jian Jin、Christopher J. Schofield、Masoud Vedadi、Yoshifumi Yokoyama和Shigeyuki Yokoyama组成的国际研究团队，在《Nature Chemistry》上发表了一项突破性研究。他们系统筛选了人源JmjC去甲基酶KDM3A的底物，意外地发现该酶不仅能催化H3K9me2/1的去甲基化，还能高效地将H3K9ac氧化为羟基乙酰化赖氨酸（H3K9acOH）。这是一种此前从未在组蛋白上报道过的、化学性质稳定的新型PTM。该发现不仅扩展了我们对2OG依赖加氧酶催化潜力的认识，更在分子层面直接揭示了组蛋白乙酰化修饰与氧气感知之间的全新桥梁，为理解缺氧微环境（如肿瘤）中表观遗传重编程机制开辟了全新道路。

本研究综合运用了多种前沿的生物化学、细胞生物学与组学技术。研究人员首先利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对重组KDM3A催化结构域与多种修饰的组蛋白H3肽段进行孵育，筛选并鉴定其催化产物。通过电喷雾-串联质谱和同位素标记实验，精确确定了羟化反应发生在乙酰基的甲基上，并证实了反应对O₂、Fe(II)和2OG的依赖性。在细胞水平，研究团队通过蛋白质印迹、免疫荧光和染色质免疫沉淀测序，利用特异性开发的H3K9acOH抗体，检测了该修饰在过表达KDM3A的HEK293T细胞中的存在、定位及基因组分布特征。此外，还通过高通量定量质谱蛋白质组学，对从转染细胞中提取的组蛋白进行了全面的修饰分析，进一步在细胞样本中确证了H3K9acOH的存在。

结果

分离的KDM3A催化H3K9ac的羟化

研究团队测试了一系列修饰的组蛋白H3肽段作为重组KDM3A催化结构域的潜在底物。正如预期，KDM3A有效催化了H3K9me1/2的去甲基化。出人意料的是，当使用H3K9ac肽段时，质谱检测到一个+16 Da的质量偏移，表明生成了羟化产物（H3K9acOH）。该反应依赖于Fe(II)、2OG和O₂，并能被2OG竞争性抑制剂IOX1所抑制。同位素O₂标记实验显示产物中高比例地掺入了单个¹⁸O原子。研究还观察到KDM3A能进一步将H3K9acOH氧化为醛基产物。值得注意的是，在相同条件下，同家族且序列高度相似的KDM3B以及作用于相同位点的其他JmjC去甲基酶（如KDM4A、KDM7B）均未显示出对H3K9ac的羟化活性，表明该功能对KDM3A具有一定特异性。

KDM3A和KDM3B羟化细胞来源组蛋白上的H3K9ac

为了探究KDM3A催化H3K9ac羟化的生物学相关性，研究人员开发了针对H3K9acOH的特异性多克隆抗体。体外实验显示，当用重组KDM3A催化结构域或全长蛋白孵育从小牛胸腺或HEK293T细胞中提取的天然组蛋白时，H3K9acOH的免疫印迹信号显著增强。有趣的是，尽管KDM3B在肽段水平无此活性，但全长KDM3B在组蛋白水平也显示出一定的H3K9acOH生成能力。KDM3A同样能够催化重组核小体上的H3K9ac发生羟化。

KDM3A/B的过表达在细胞内升高H3K9acOH水平

在HEK293T细胞中过表达催化活性型（野生型，WT）而非失活突变型（Mut）的HA标签KDM3A或KDM3B的C端结构域或全长蛋白，通过蛋白质印迹和免疫荧光均检测到全局H3K9acOH水平的升高，同时伴随H3K9me2/1水平的预期下降。而过表达其他作用于H3K9的去甲基酶（如KDM4D、KDM7B）则无此效应，进一步支持了细胞内H3K9acOH的形成是KDM3A/B依赖性的。

HDAC抑制剂处理增加细胞内全局H3K9acOH水平

用I/II类组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A处理HEK293T细胞，导致全局H3K9ac水平升高，同时H3K9acOH水平也呈现剂量和时间依赖性的增加。这可能是由于TSA抑制了HDACs，导致H3K9ac底物积累，进而被内源性KDM3A/3B羟化。生化实验表明，III类HDAC SIRT1对H3K9acOH的脱酰基活性远低于对H3K9ac，而I类HDAC8对两者的活性差别不大。此外，H3K9acOH能被含有YEATS结构域的“阅读器”蛋白AF9识别，尽管亲和力略低于H3K9ac。

KDM3A诱导的H3K9acOH在HEK293T细胞中的表征

研究人员对过表达HA-KDM3A-WT或Mut的HEK293T细胞中提取的组蛋白进行了基于质谱的定量修饰组学分析。在KDM3A-WT组中，成功鉴定并确证了携带H3K9acOH修饰的肽段，其色谱行为和碎片谱图与合成的标准品一致。定量分析显示，与Mut组相比，KDM3A-WT组中H3K9acOH的相对丰度显著增加，同时H3K9me2丰度下降，H3K9ac和未修饰H3K9丰度上升，与抗体检测结果一致。染色质免疫沉淀测序分析显示，在未处理的HEK293T细胞中，H3K9acOH与H3K9ac、H3K4me3共定位于高表达基因的转录起始位点附近，提示其可能参与活跃转录的调控。

结论与讨论

本研究通过系统的生物化学、细胞生物学和多组学分析，首次揭示并证实了人源JmjC去甲基酶KDM3A能够催化组蛋白H3K9ac发生羟化，生成一种新型、稳定的翻译后修饰——H3K9羟基乙酰化赖氨酸。这一发现打破了JmjC-KDMs仅作为去甲基酶的固有认知，揭示了其作为多功能氧化酶的催化可塑性。该反应严格依赖于O₂、Fe(II)和2OG，与HIF通路中的关键感应酶（如FIH、PHDs）特性一致，从而在分子层面直接建立了组蛋白乙酰化修饰与细胞氧感知之间的全新联系。

其重要意义在于：首先，拓展了表观遗传修饰的“化学图谱”，H3K9acOH作为一种新发现的稳定修饰，可能通过改变与“阅读器”蛋白（如AF9）的相互作用、影响其他酶（如HDACs、HATs、KDMs）的活性或作为进一步修饰的前体，形成更复杂的调控网络。其次，深化了对缺氧应答表观遗传机制的理解。KDM3A本身是HIF的靶基因，在缺氧时上调，其催生的H3K9acOH修饰可能在缺氧诱导的染色质重塑和基因表达重编程中扮演独特角色，为癌症等缺氧相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点和思路。最后，挑战了酶的简单功能分类，提示其他JmjC氧合酶乃至整个2OG依赖氧合酶超家族可能存在尚未被发现的、多样化的催化活性与生物学底物。

总之，这项研究不仅发现了一种全新的组蛋白修饰，更重要的是，它像一座“化学桥梁”，将环境氧信号、2OG依赖的酶催化与核心的表观遗传调控机制紧密相连，为未来在生理、病理条件下深入研究氧感应与基因表达调控的交互作用开辟了富有前景的新方向。