《Nature Communications》：Genome-wide CRISPR screens in primary human natural killer cells identify countermeasures against immunosuppressive environment
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为克服免疫抑制性肿瘤微环境对自然杀伤(NK)细胞免疫疗效的限制，本研究构建了原发性人NK细胞的CRISPR功能缺失筛选平台，通过全基因组与激酶组筛选，鉴定出调控NK细胞增殖、细胞毒性及抵抗前列腺素E2(PGE2)抑制的关键基因，包括增强扩增的STK17B、提升杀伤力的CCDC53以及抑制IL-2信号的CRL5复合物(RNF7、UBE2F、CISH)，为优化基于NK细胞的肿瘤免疫治疗提供了新靶点。
在对抗癌症的战争中，我们的免疫系统拥有一支名为自然杀伤细胞（Natural Killer cells， 简称NK细胞）的精锐部队。它们是天生的“刺客”，能够迅速识别并摧毁发生癌变的异常细胞，是癌症免疫疗法中备受瞩目的潜力股。然而，狡猾的肿瘤细胞并非坐以待毙，它们会在自己周围构建一个名为“肿瘤微环境”的“堡垒”，这个环境中充满了各种免疫抑制因子，就像施放了“虚弱诅咒”，让NK细胞的战斗力大打折扣，极大地限制了免疫疗法的实际效果。为了打破这个僵局，一个核心的科学问题摆在面前：在NK细胞内部，究竟是哪些“开关”在调控着它们对抗这种免疫抑制环境的能力？如果能够精准地找到并调控这些“开关”，是否就能像升级装备一样，显著增强NK细胞在肿瘤“堡垒”中的生存和作战能力？
为了回答这些问题，一支研究团队在《自然·通讯》（Nature Communications）杂志上发表了一项开创性研究。他们巧妙地构建了一个专门用于原发性人类NK细胞的功能基因组学研究平台。这个平台的核心是将一种经过改造、不携带Baevrless蛋白假型化的慢病毒（用于高效递送sgRNA文库）与电穿孔递送Cas9蛋白的技术相结合，从而首次实现了在未经永生化改造的原代NK细胞中进行全基因组规模的CRISPR功能缺失筛选。这就像是为NK细胞内部数以万计的基因准备了一份详尽的“功能调查问卷”。
研究人员利用这个强大的平台，展开了两轮深入的“筛查”：一轮聚焦于与细胞信号传导密切相关的“激酶组”，另一轮则覆盖了几乎全部的基因（全基因组）。他们的目标是找出那些能够显著影响NK细胞三个核心能力的基因：自身的增殖（扩增能力）、对肿瘤细胞的直接杀伤力（细胞毒性），以及抵抗肿瘤微环境中一种关键免疫抑制因子——前列腺素E2(PGE2)的能力。
通过严密的筛选和验证，几组关键的“基因开关”浮出水面。首先，研究人员发现了一个名为STK17B的基因。当这个基因的功能被“关闭”（敲除）后，NK细胞展现出了更强大的自我扩增能力。这意味着，靶向抑制STK17B或许能帮助我们在体外获得更多数量、更具活力的NK细胞用于治疗。其次，一个名为CCDC53的基因引起了注意。敲除CCDC53能够显著提升NK细胞的脱颗粒水平和细胞毒性，相当于直接增强了它们的“武器”威力。
最引人注目的发现来自于对PGE2抑制环境下NK细胞功能的研究。筛选结果将矛头指向了一个名为CRL5的蛋白质复合物。这个复合物包含多个成员，如RNF7、UBE2F以及一个已知的免疫检查点相关基因CISH。研究证实，这个CRL5复合物在PGE2造成的压力环境下，扮演了关键的“刹车”角色，它通过负向调控白细胞介素-2（IL-2）的信号通路，强力抑制了NK细胞的活化和效应功能。当这些“刹车”基因（如RNF7或UBE2F）被敲除后，NK细胞即使在PGE2的包围下，也能保持更强的IL-2信号响应和杀伤功能。这为设计能够抵抗肿瘤微环境抑制的“强化型”NK细胞提供了非常具体的靶点。
这项研究的意义是双重的。在方法论上，它成功建立了一个可扩展的、适用于原代人类NK细胞的CRISPR筛选平台，为未来深入研究这一重要免疫细胞的功能基因组学打开了大门。在应用层面，研究鉴定出的多个基因靶点（如STK17B、CCDC53以及CRL5复合物成员）为下一代NK细胞免疫疗法的工程化改造提供了清晰的路线图。通过基因编辑技术精确调控这些靶点，有望制造出增殖能力更强、杀伤效力更高、且能抵抗肿瘤免疫抑制环境的“超级NK细胞”，从而突破当前细胞免疫疗法在实体瘤治疗中的瓶颈，为更多癌症患者带来希望。
本研究主要采用了以下几项关键技术方法：首先，建立了针对原代人NK细胞的CRISPR-Cas9功能缺失筛选平台，其关键技术结合了BaEVRless假型化慢病毒递送sgRNA文库与原代细胞Cas9蛋白电穿孔。其次，利用此平台进行了全基因组规模及激酶组聚焦的CRISPR筛选，以系统鉴定调控NK细胞功能的关键基因。研究在PGE2存在条件下进行筛选，以模拟肿瘤免疫抑制微环境。此外，通过流式细胞术、细胞毒性测定、免疫印迹和RNA测序等技术，对筛选出的候选基因进行了多层次的功能验证。
CRISPR筛选平台的建立与验证
研究人员开发了一个适用于原代人NK细胞的高通量CRISPR筛选流程。他们通过将优化的慢病毒转导与Cas9蛋白电穿孔相结合，成功在原代NK细胞中实现了高效的基因敲除。平台验证表明，该系统能介导稳健的基因编辑，并支持基于增殖或细胞表面标志物表达的功能性筛选。
激酶组与全基因组筛选鉴定NK细胞功能调控因子
利用上述平台，研究团队首先进行了激酶组筛选。结果显示，敲除STK17B能显著促进NK细胞在白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-15(IL-15)刺激下的增殖。随后的全基因组筛选进一步确认了STK17B是细胞周期进程的负调控因子。同时，全基因组筛选还鉴定出CCDC53是细胞毒性的负调控因子，其缺失可增强NK细胞的脱颗粒和靶细胞杀伤能力。
在PGE2介导的免疫抑制下筛选获得性抵抗的调控因子
为了找出能帮助NK细胞抵抗肿瘤微环境免疫抑制的因子，研究在添加PGE2的条件下进行了CRISPR筛选。分析发现，Cullin-RING泛素连接酶5(CRL5)复合物的多个组分，包括接头蛋白RNF7、结合酶UBE2F以及底物衔接蛋白CISH，其缺失能使NK细胞在PGE2环境中获得生长优势。这表明CRL5复合物是PGE2介导抑制的关键中介。
CRL5复合物是PGE2抑制IL-2信号通路和效应功能所必需的
机制研究表明，PGE2通过其受体信号上调了CRL5复合物核心组件RNF7的表达。CRL5复合物则通过促进信号转导与转录激活因子5(STAT5)的泛素化降解，来负向调控IL-2/STAT5信号通路。敲除RNF7或UBE2F能阻断PGE2对STAT5磷酸化及下游细胞因子诱导的STAT5靶基因表达的抑制作用，从而恢复NK细胞的效应功能。
靶向CRL5复合物可增强NK细胞在体内的抗肿瘤活性
最后，研究在体内模型中验证了上述发现的治疗潜力。与对照NK细胞相比，敲除了RNF7的NK细胞在过继转移后，在携带前列腺癌异种移植的小鼠模型中表现出更强的持久性和抗肿瘤疗效。这证明靶向CRL5复合物是提高NK细胞疗法在免疫抑制性肿瘤微环境中效果的有效策略。
研究结论与讨论
本研究成功地构建了一个用于原代人NK细胞的规模化CRISPR筛选平台，并利用该平台系统性地绘制了调控NK细胞增殖、细胞毒性及抵抗免疫抑制的关键基因图谱。研究发现，STK17B是NK细胞扩增的负调控因子，而CCDC53是细胞毒性的负调控因子。更重要的是，研究揭示了CRL5复合物（包含RNF7, UBE2F, CISH）是介导PGE2免疫抑制功能的核心枢纽，它通过负调控IL-2/STAT5信号通路来削弱NK细胞的活性。在讨论中，作者强调了这项工作的多重意义：其一，所建立的筛选技术填补了在难以转染的原代免疫细胞中进行大规模功能遗传学研究的空白；其二，鉴定出的全新靶点（如STK17B, CCDC53和CRL5组分）为通过基因工程手段增强NK细胞疗法的效力提供了明确的候选目标。特别是针对CRL5复合物的干预，有望打破肿瘤微环境中PGE2等介质建立的免疫抑制屏障，从而显著提升过继性NK细胞免疫疗法在治疗实体瘤中的前景。这项工作从基础机制和转化应用两个层面，为发展下一代高效、持久的NK细胞抗癌疗法奠定了坚实的基础。
