基因修饰人造血干祖细胞临床前评估：NSG与NBSGW小鼠模型的比较分析

《Stem Cell Research & Therapy》：Comparative analysis of NSG and NBSGW mice for preclinical evaluation of gene-modified human hematopoietic stem and progenitor cells

本研究的推荐语：基因治疗产品的临床前安全性评估需可靠的人源化小鼠模型。研究人员针对这一问题，系统比较了NSG与NBSGW两种模型在评估慢病毒载体（LVV）转导和CRISPR/Cas9基因编辑人造血干祖细胞（HSPCs）时的表现。研究发现，NBSGW小鼠的高水平人源嵌合可能掩盖LVV高拷贝数HSPCs的植入缺陷，而CRISPR/Cas9编辑的长期再植造血干细胞（LT-HSCs）在两种模型中植入能力相当。该研究强调，严谨的模型选择对基因疗法走向临床至关重要。

　　

在探索治愈遗传性血液疾病的征途上，科学家们将希望寄托于基因疗法——通过直接修正患者造血干祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPCs）中的致病基因，有望实现一次治疗、终身获益的愿景。然而，在将这类革命性疗法推向临床之前，必须先在动物模型中对其安全性和有效性进行严格的“压力测试”。人源化小鼠模型，即将人造血细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，正是这场“压力测试”的核心平台。其中，NOD-scid IL2Rγ^null(NSG) 小鼠因其强大的免疫缺陷特性，已成为该领域的黄金标准。近年来，一种名为NBSGW（携带Kit^W41突变）的新型小鼠模型崭露头角，其在小鼠自身造血缺陷的加持下，能够支持更高水平的人源细胞植入。这就带来了一个亟待解答的关键问题：在评估基因修饰HSPCs时，这两种“明星”模型的表现是否一致？哪种模型更能“火眼金睛”地识别出潜在风险，从而为临床转化提供更可靠的决策依据？

为了回答上述问题，研究团队设计了一项精密的比较研究，核心是评估两种主流的基因修饰技术——慢病毒载体（Lentiviral Vector, LVV）转导和CRISPR/Cas9基因编辑——在人HSPCs中产生的影响，在NSG与NBSGW两种模型中的表现有何异同。研究采用的主要技术方法包括：利用慢病毒转导或CRISPR/Cas9联合单链寡脱氧核苷酸（single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN）供体对人脐带血来源的CD34⁺HSPCs进行基因修饰；将修饰后的细胞通过尾静脉注射移植到亚致死剂量辐照处理后的NSG或NBSGW小鼠体内，并在移植后16-20周分析其长期植入与多谱系分化能力；运用流式细胞术定量分析外周血和骨髓中人源细胞嵌合率（hCD45⁺）及各细胞谱系比例；通过液滴式单细胞RNA测序（scRNA-seq）深度解析植入人源细胞的转录组特征和细胞群体组成。

LVV高拷贝数HSPCs在NSG小鼠中表现出植入缺陷，但在NBSGW小鼠中此缺陷被高嵌合水平所掩盖。

研究人员首先探究了慢病毒转导的影响。他们发现，移植了携带高LVV拷贝数（每个细胞>5个拷贝）HSPCs的NSG小鼠，其骨髓中人源细胞（hCD45⁺）的总体植入水平，显著低于移植了低拷贝数或未转导细胞的对照组。然而，在NBSGW小鼠中，无论移植的HSPCs携带的LVV拷贝数高低，其最终达到的人源细胞嵌合率都非常高，且组间没有显著差异。这一结果清晰地表明，NSG模型能够敏感地检测出LVV高拷贝数对HSPCs植入能力的负面影响，而NBSGW模型因其固有的、更强的支持人源细胞生长的能力，可能“稀释”或掩盖了这部分有缺陷细胞的表型，从而在评估中遗漏了重要的安全性风险信号。

CRISPR/Cas9基因编辑的HSPCs在两种小鼠模型中展现出相当的植入与基因校正能力。

与LVV转导的结果形成对比，当研究团队使用CRISPR/Cas9系统结合ssODN供体对HSPCs进行基因校正时，观察到了不同的景象。在目标位点，两种小鼠模型中检测到的基因校正效率相当。更重要的是，即使逐渐降低移植的细胞剂量，经过CRISPR/Cas9编辑的长期再植造血干细胞（Long-Term Repopulating Hematopoietic Stem Cells, LT-HSCs）在NSG和NBSGW小鼠中都表现出了同等的植入与多谱系重建能力。这说明，CRISPR/Cas9编辑本身（至少在本研究采用的方案下）并未对HSPCs的长期再生潜能造成可检测到的损害，且这种评估结论在两种模型间具有一致性。

单细胞RNA测序揭示NBSGW小鼠能更好地支持人多谱系造血，保存了NSG模型中缺失的祖细胞群体。

为了深入理解模型差异的细胞基础，研究进行了单细胞RNA测序分析。结果发现，在NBSGW小鼠骨髓中重建的人源造血系统，其细胞组成更加丰富，更接近生理状态。一些特定的、处于分化早期的髓系和淋系祖细胞群体，在NSG受体中代表性严重不足，但在NBSGW受体中则得到了很好的保留。这从分子层面证实，NBSGW小鼠具有更优越的、支持人多谱系造血（特别是髓系发育）的微环境能力。

结论与讨论

本研究通过系统性比较，明确了NSG和NBSGW两种人源化小鼠模型在基因修饰HSPCs临床前评估中的各自特点与适用场景。总体而言，两种模型都适用于评估HSPCs的长期植入能力和基因修饰的持久性。然而，它们的关键差异决定了其应用侧重：NSG模型因其相对“苛刻”的植入环境，能更敏感地揭示由基因修饰过程（如LVV高拷贝数整合）导致的细胞内在植入缺陷，因此在评估治疗产品的安全性风险（特别是与载体相关的毒性）时可能更具优势。相反，NBSGW模型凭借其极高的基础嵌合水平，能更充分地展现HSPCs，尤其是经过精确编辑如CRISPR/Cas9校正后的HSPCs的再生潜力，为评估治疗效果和剂量探索提供了强大的平台，但其“高背景”也可能掩盖部分细胞亚群的功能损伤。

这项研究的重要启示在于，没有一种“万能”的模型。针对不同的基因修饰策略（如病毒载体转导与基因编辑）、不同的评估目标（安全性警示与疗效验证），需要审慎选择最合适的临床前模型。将NSG模型对缺陷的敏感性与NBSGW模型对多谱系重建的充分支持性结合考量，甚至进行互补性验证，才能对基因治疗产品做出更为全面和严谨的临床前评价，从而更稳健地推动其走向临床应用，最终惠及患者。该研究成果已发表于《Stem Cell Research》期刊。