《Advanced Science》：Glomage: A Multimodal Platform for High-Content Morphological and RNA Profiling of Glomeruli in Zebrafish and Mouse Models
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为解决慢性肾病研究中肾小球高分辨率3D成像、足细胞定量及跨物种高通量分析的技术瓶颈，研究人员开发了多模态平台Glomage。该平台可在斑马鱼幼体和小鼠中实现肾小球的高通量分离、免疫荧光3D成像、足细胞自动化计数及高纯度RNA提取，首次系统性量化了斑马鱼幼体肾小球的足细胞数量，并在足细胞损伤模型中验证了药物NM_187的保护作用。该工作为肾小球病理机制研究与药物筛选提供了高效、跨物种的高内涵分析框架。
慢性肾脏病影响着全球超过8.5亿人，但目前有效的治疗策略仍然有限。作为肾脏的核心过滤单元，肾小球的结构与功能高度依赖于足细胞（podocyte）这种终末分化且几乎无法再生的细胞所构成的复杂三维结构。然而，足细胞的复杂形态使得对其进行规模化分析变得异常困难，这严重阻碍了针对肾脏疾病的药物研发进程。与此同时，现有的研究技术——无论是传统的组织切片（仅能提供二维“快照”），还是先进的全器官光片成像（耗时且设备要求高）——都难以在保持三维结构完整性的同时，实现高通量、可重复的分析。斑马鱼（zebrafish）幼体因其体积小、通体透明、基因操作便捷且肾脏结构与哺乳动物高度保守，成为研究肾脏发育与疾病的理想模型。但如何从大量斑马鱼幼体中高效、无损地获取完整的肾小球，并同步进行精细的形态学观察和分子生物学分析，一直是该领域亟待突破的技术瓶颈。
为攻克这些难题，研究人员开发了一个名为“Glomage”的跨物种高通量多模态平台。该研究发表在国际知名期刊《Advanced Science》上，旨在建立一套能够对斑马鱼和小鼠模型的肾小球进行大规模、高内涵三维形态分析与RNA谱分析的标准化流程。
为了开展此项研究，研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：
首先，建立了高效的肾小球批量分离技术。对于斑马鱼，研究者使用了携带足细胞特异性表达绿色荧光蛋白（eGFP）或mCherry的转基因品系，通过机械震荡法（如Fast-Prep-24设备配合陶瓷珠）从大量经多聚甲醛（PFA）固定的幼体中快速释放出完整的肾小球，并利用荧光体视显微镜进行手动收集。对于小鼠，则采用已发表的筛网过滤结合差异粘附法从肾脏中分离出肾小球。其次，开发了适用于批量样本的免疫荧光染色与三维成像流程。将收集到的肾小球置于带有滤膜的细胞培养插片中，在24孔板内完成全套免疫染色，再将滤膜整体封片，通过共聚焦显微镜进行自动化、多倍率的图像采集，获得高分辨率的三维Z-stack数据。第三，引入了基于人工智能（AI）的图像定量分析。利用Imaris等软件，对三维图像中的足细胞核（通过内源性荧光蛋白扩散标记）进行自动分割、计数，并对肾小球体积、球形度等进行量化。最后，建立了高纯度肾小球RNA的提取与分子分析方法。对未固定的斑马鱼幼体进行温和解离，手动挑取肾小球后，使用单细胞RNA纯化试剂盒提取RNA，进而通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析足细胞特异性基因的表达变化。
研究结果
2.1 Glomage：高通量分离斑马鱼幼体肾小球
研究人员成功建立了从100只固定后的斑马鱼幼体中批量分离完整肾小球的流程。利用足细胞表达eGFP的转基因品系（Podo:GFP），通过优化固定与解（dissociation）参数，实现了对完整肾小球的高效释放与收集，平均每100只幼可得约68个完整肾小球，回收率约68%。
2.2 Glomage：用于幼体肾小球3D免疫荧光分析的平台
将经过斑马鱼冷冻切片验证的抗体应用于完整肾小球染色，成功实现了对足细胞裂孔隔膜蛋白（nephrin, podocin）、肾小球基底膜成分（laminin）、壁层上皮细胞标志物（Pax2a）及内皮细胞（Ehd3）等关键结构的三维可视化。结果表明，该在完整肾小球中同样能获得特异、可重复的染色效果，首次实现了对大量完整肾小球中多靶点结构的快速免疫标记。
2.3 Glomage：快速定量完整幼体肾小球足中足细胞总数
利用eGFP蛋白可自由入足细胞核的特性，结合AI图像分析， 对5天（5 dpf）的马鱼肾小球进行三维核分割与计数， 首次准确定量了其足细胞数量， 平均每个肾小球含有88.40个足细胞（SD: 13.23）。
2.4 Glomage：足细胞损伤模型中的足细胞定量
在硝唑尼（NFP）诱导的（FSGS）样足细胞损伤模型中，应用该平台进行定量分析。结果显示，NFP处理导致足细胞核体积显著减小、活足细胞数量约下降50%。而同时给予保护性小分子化合物NM_187共处理，可完全足细胞的丢失。
2.5 Glomage：健康与细胞肾小球的体积（volumetric）分析
2.5 在足细胞损伤， N处理还导了表达阳性足细胞质体积的显减少和肾小球球形度的下降， NM_187处理可恢体积复到接近对水平，在形学上验证了NM的保护作用。
2.6 ： 高纯肾小球RNA的分离****
建立了从非固定幼体中提取鱼幼肾鱼分离高鱼幼体纯肾小球RNA的流程。RT-PCR和RT-q结果显， 分离肾鱼RNA高度富集了足细胞特异性基因（<n）<nphs2）<
