《HUMAN MUTATION》：PAPPA2 c.392G>C Heterozygous Mutation Associates Primary Open-Angle Glaucoma in a Chinese Family
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本刊特约编辑推荐：为揭示原发性开角型青光眼（POAG）的遗传学病因，研究者围绕一个呈现常染色体显性遗传的中国POAG家系展开工作。通过全外显子组测序鉴定出PAPPA2基因c.392G>C杂合突变，并证实该突变导致PAPPA2蛋白稳定性降低。进一步研究发现，在眼房水中PAPPA2水平降低伴随其底物IGFBP5水平升高，证实PAPPA2可切割IGFBP5。在体外细胞模型及Pappa2基因敲除小鼠模型中，研究均证实PAPPA2-IGFBP5轴功能失调可通过诱导小梁网细胞纤维化，进而导致眼压升高及POAG样表型。该研究揭示了调控细胞外基质稳态的眼局部PAPPA2-IGFBP5轴在POAG发病中的关键作用，为POAG的治疗提供了新的潜在靶点。
青光眼，这个悄无声息的“视力窃贼”，是全球范围内不可逆性失明的首要原因。其中，原发性开角型青光眼（Primary Open-Angle Glaucoma, POAG）是最常见的类型。它的特点是前房角开放，但眼内压（Intraocular Pressure, IOP）升高或正常，其具体的发病机制至今尚未完全阐明。眼压升高是青光眼一个主要的危险因素，而眼压的稳定有赖于房水的生成与排出平衡。房水主要由睫状体产生，主要经由小梁网途径流出。当小梁网组织发生纤维化时，房水流出阻力增加，导致眼压升高，从而诱发或加剧青光眼的病理进程。因此，深入探究小梁网纤维化的调控机制，对于理解POAG的发病原理和开发新的治疗策略至关重要。
另一方面，遗传因素在青光眼发病中扮演着重要角色。大约60%的青光眼患者有家族史，家族研究表明，青光眼患者的一级亲属患病风险是普通人群的10倍。目前，已在一些POAG家系中发现了一些单基因变异，如MYOC、OPTN等。然而，仍有许多POAG病例的遗传病因不明，寻找新的致病基因和通路是当前研究的重点。
正是基于上述背景，研究人员针对一个多代罹患POAG的中国家系展开了深入研究。他们的目标很明确：寻找导致这个家族性POAG的遗传突变，并深入解析该突变如何通过影响特定的分子通路，最终导致小梁网功能障碍和POAG的发生。这项研究成果最终发表在《HUMAN MUTATION》期刊上。
为了开展这项研究，作者团队综合运用了多种关键的技术方法。首先，他们从家系成员中采集静脉血样本进行全外显子组测序，以筛查与疾病共分离的基因变异，并通过Sanger测序进行验证。利用蛋白质印迹法（Western Blotting）检测了突变对PAPPA2蛋白稳定性的影响，以及POAG患者与对照组房水中PAPPA2和IGFBP5的蛋白水平。通过体外蛋白纯化与共孵育实验，验证了PAPPA2对IGFBP5的切割活性。在细胞功能层面，研究使用了从人眼小梁网组织分离培养的原代人小梁网细胞（HTMCs）作为模型，通过RNA测序（RNA-seq）分析了IGFBP5过表达对细胞转录组的影响，并结合蛋白质印迹和免疫荧光染色技术，检测了纤维化相关蛋白的表达变化。最后，在动物模型层面，研究者利用了Pappa2基因敲除小鼠，通过测量眼压、进行苏木精-伊红（H&E）染色和马松（Masson）染色，在体验证了PAPPA2剂量不足对眼压和小梁网胶原沉积的影响。
研究结果
3.1. 一个患有POAG的中国家系
研究者发现了一个五代的POAG中国家系，包含55名成员，其中13人患病。先证者（V1）年仅15岁。患者表现出典型的青光眼性视神经病变，如视杯扩大、视野缺损、眼压升高且前房角开放。该家系呈现典型的常染色体显性遗传模式。
3.2. 全外显子组测序在家系中发现候选变异PAPPA2 c.392G>C
通过对家系成员（10名患者，5名未患病者）进行全外显子组测序，筛选出一个与疾病完全共分离的杂合突变：PAPPA2基因c.392G>C（NM_020318.3）。该突变仅存在于患病成员中，并经Sanger测序证实。该突变导致第131位氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸（p.Gly131Ala）。
3.3. PAPPA2 c.392G>C突变降低其蛋白稳定性
体外实验表明，与野生型相比，携带c.392G>C突变的PAPPA2其mRNA水平无变化，但蛋白在细胞质和细胞培养上清中的水平均显著降低，表明该突变影响了PAPPA2的蛋白稳定性。
3.4. PAPPA2在眼房水中切割IGFBP5
研究发现PAPPA2及其底物IGFBP5在人的眼房水中均有表达。重要的是，在POAG患者的房水中，PAPPA2水平显著降低，而IGFBP5水平则升高。体外蛋白纯化与切割实验证实，PAPPA2能够切割IGFBP5。
3.5. IGFBP5过表达引起原代HTMCs转录组改变
在原代HTMCs中过表达IGFBP5并进行RNA测序，结果显示2617个基因表达发生差异，其中1235个上调，1382个下调。通路富集分析显示，差异表达基因富集于细胞外基质组织和胶原代谢过程。纤维化相关基因（如COL3A1、COL4A4、MYOC等）的表达上调。
3.6. IGFBP5诱导原代HTMCs中纤维化相关蛋白上调
用IGFBP5蛋白处理原代HTMCs，可显著上调纤维化相关蛋白COL3A1、COL4A4、αSMA和MYOC的表达。而共同加入PAPPA2蛋白则可抵消IGFBP5的上述效应。免疫荧光染色结果进一步证实了这一发现。
3.7. Pappa2剂量不足在小鼠模型中导致POAG样表型
在Pappa2基因敲除小鼠模型中发现，杂合子（Pappa2+/-）和纯合子（Pappa2-/-）小鼠眼内Pappa2蛋白水平降低或缺失，而Igfbp5水平升高。与野生型小鼠相比，Pappa2+/-和Pappa2-/-小鼠的眼压显著升高，且小梁网组织中胶原沉积面积增加。这表明眼局部PAPPA2剂量不足足以导致眼压升高和小梁网纤维化。
研究结论与讨论
本研究通过遗传学、分子生物学、细胞学及动物模型等多层次证据，系统阐明了一个新的POAG致病机制。在一个中国POAG家系中发现的PAPPA2 c.392G>C杂合突变，通过降低PAPPA2蛋白的稳定性，导致其在眼房水中的水平下降。功能正常的PAPPA2可以切割其底物IGFBP5，而当PAPPA2不足时，IGFBP5积累。过量的IGFBP5能诱导人小梁网细胞发生纤维化，上调包括胶原蛋白在内的多种细胞外基质成分的表达，这可能是导致小梁网流出阻力增加、眼压升高的关键环节。最终，在Pappa2基因敲除小鼠模型中，研究者直观地观察到了PAPPA2剂量不足直接引起的眼压升高和小梁网胶原沉积现象，完美地在体印证了上述机制。
PAPPA2是一种属于锌指金属蛋白酶家族的分泌蛋白，主要通过切割胰岛素样生长因子结合蛋白5（IGFBP5）来调节胰岛素样生长因子1（IGF1）的生物利用度。本研究首次将PAPPA2的功能与眼部疾病特别是POAG联系起来，揭示了眼局部存在一个先前未知的、对房水流出通路稳态至关重要的PAPPA2-IGFBP5调节轴。该轴的破坏，无论是由于基因突变导致的PAPPA2蛋白功能不全，还是其他原因引起的PAPPA2/IGFBP5比例失衡，都可能通过促进小梁网纤维化而参与POAG的发病。
这一发现具有重要的科学意义和潜在的临床转化价值。首先，它为POAG，特别是家族性POAG，提供了一个新的遗传病因和药物靶点。针对PAPPA2-IGFBP5轴，未来或可开发增强PAPPA2活性或抑制IGFBP5功能的疗法，以达到抗小梁网纤维化、降低眼压、治疗POAG的目的。其次，该研究加深了我们对眼局部内分泌微环境在维持眼压稳态中作用的理解。总之，这项研究不仅解开了一个POAG家系的遗传谜题，更重要的是，它为我们理解青光眼的复杂病理机制打开了一扇新的窗口，为未来开发新的治疗策略奠定了坚实的理论基础。
