单细胞虚拟扰动筛选揭示STAT3是牙本质发生的关键转录调控因子

《Cell Proliferation》：Single-Cell Virtual Perturbation Screening Identifies STAT3 as a Key Regulator of Dentinogenesis

本研究通过整合单细胞转录组学、虚拟基因敲除（CellOracle）与体内外功能验证，系统揭示了STAT3在调控牙源性间充质细胞向成牙本质细胞分化及牙本质形成中的核心作用。研究人员发现，STAT3通过直接转录激活WNT2B，驱动Wnt/β-catenin信号通路，从而调控牙本质形成。STAT3的条件性敲除导致小鼠牙本质发育不良。该研究为理解牙本质发育障碍的分子机制提供了新见解，并为牙本质再生治疗提供了潜在靶点。

　　

牙齿是我们身体中最坚硬的结构，承担着咀嚼食物、辅助发音和维持面部形态的重要功能。牙齿的主体由牙本质构成，这是一种高度矿化的组织，包裹着内部的牙髓，起到保护和支撑的作用。牙本质的形成，即牙本质发生，是一个精密调控的生理过程，其核心是牙源性间充质细胞分化为成牙本质细胞，进而分泌和矿化细胞外基质。然而，这一过程中的分子调控网络异常复杂，许多关键调控因子尚未被阐明。牙本质发育障碍，如牙本质发育不全和牙本质发育不良，是常见的先天性牙科疾病，可导致牙齿结构脆弱、牙根短小和过早磨损，严重影响患者的口腔健康与生活质量。尽管一些致病基因如DSPP、DMP1已被发现，但更上游的、调控成牙本质细胞谱系分化的关键转录因子和信号通路仍知之甚少。为了全面揭示牙本质发生的转录调控机制，识别新的治疗靶点，研究人员开展了这项整合生物信息学预测与多层次实验验证的研究。

本研究主要应用了以下几项关键技术方法：1. 对来源于人牙源性组织的单细胞转录组数据（GEO: GSE146123）进行分析，包括细胞聚类、拟时序分析和细胞命运映射（CellRank）。2. 利用SCENIC框架进行基因调控网络推断和调节子特异性评分，筛选关键转录因子。3. 使用CellOracle和scTenifoldKnk进行STAT3的虚拟敲除，预测其对细胞命运和基因网络的影响。4. 在体外利用短发夹RNA(shRNA)介导的基因沉默和药理学调控（抑制剂AG490和激动剂colivelin）在从健康第三磨牙提取的人牙髓细胞(hDPCs)中验证STAT3功能。5. 在体内构建并分析在表达Osterix(Osx)的成牙本质细胞前体细胞中条件性敲除Stat3基因的小鼠模型（Stat3^fl/fl;Osx^Cre），通过显微CT、组织学染色、动态荧光双标等方法评估牙表型。6. 通过RNA测序(RNA-seq)、染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因实验，揭示STAT3的下游作用机制。

3.1 人牙源性组织的单细胞转录图谱

通过对24,177个高质量细胞进行单细胞转录组分析，研究人员绘制了发育中牙微环境的细胞异质性图谱。UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection，均匀流形逼近与投影）降维和聚类分析识别出9种主要细胞类型。其中，对10,353个牙源性间充质谱系细胞进行亚群分析，确定了6个亚组，包括CTHRC1⁺、EFNB2⁺和FOS⁺间充质细胞。拟时序分析（Slingshot算法）显示EFNB2⁺间充质细胞位于发育轨迹的根部，是主要的祖细胞群，具有最高的干性评分。结合CellRank命运概率分析和SCENIC调节子特异性评分(RSS)，研究人员将信号转导和转录激活因子3(STAT3)鉴定为调控成牙本质细胞谱系分化的关键驱动基因。

3.2 计算机模拟STAT3敲除扰乱成牙本质细胞谱系的命运

为探究STAT3的功能影响，研究人员利用CellOracle进行了STAT3的虚拟敲除分析。结果显示，STAT3的缺失导致了转录调控网络的动力学重塑，扰乱的矢量场预测细胞状态的迁移方向整体偏离了成牙本质前体细胞，表明STAT3对于驱动间充质前体细胞向成牙本质细胞谱系的命运决定至关重要。scTenifoldKnk分析进一步证实，STAT3扰动伴随着多个发育相关基因表达的显著变化，这些基因在Wnt信号通路等与细胞分化和牙源性代谢密切相关的通路中显著富集。

3.3 敲低牙源性间充质细胞中的STAT3损害成牙本质细胞分化

为验证计算机模拟的预测，研究人员在体外分离培养了人牙髓细胞(hDPCs)，并诱导其向成牙本质细胞分化。研究发现，在分化过程中，STAT3的表达水平和磷酸化水平均逐渐升高。通过shRNA敲低hDPCs中的STAT3基因，显著损害了细胞的增殖能力以及成牙本质细胞的分化和矿化能力，相关标志物（如ALP、DSPP、DMP1、BGLAP）的表达下调。

3.4 条件性敲除成牙本质细胞前体中的Stat3导致牙本质发育不良

为了在体内验证STAT3的功能，研究人员构建了在Osterix(Osx)表达的成牙本质细胞前体细胞中条件性敲除Stat3的小鼠模型（Stat3^fl/fl;Osx^Cre）。与对照组相比，敲除小鼠表现出多层次的牙齿缺陷，包括牙本质宽度减少、牙根缩短、第三磨牙萌出延迟。显微CT定量分析和组织学评估证实了牙本质形成受损。此外，门牙损伤修复实验表明，Stat3敲除小鼠的牙齿修复能力也显著下降。

3.5 STAT3是牙本质发生中潜在的药理学靶点

STAT3既是一个转录因子，也是一个可通过磷酸化调控的信号靶点。研究人员使用JAK2抑制剂AG490抑制STAT3磷酸化，发现这显著减弱了hDPCs的增殖和成牙本质细胞分化能力。相反，使用神经保护肽colivelin激活STAT3磷酸化，则促进了hDPCs的增殖和分化能力。这表明STAT3的活性状态可被药理学调控，并影响牙本质发生，提示其作为治疗靶点的潜力。

3.6 STAT3通过转录调控WNT2B来调节成牙本质细胞分化

为阐明STAT3调控成牙本质细胞分化的分子机制，研究人员对STAT3敲低的hDPCs进行了RNA测序(RNA-seq)分析。通路富集分析显示，下调的基因在Wnt信号通路中显著富集。其中，WNT2B被确定为最有可能的STAT3下游靶基因。验证实验表明，STAT3敲低导致WNT2B表达显著下降。过表达WNT2B能够部分挽救因STAT3失活（AG490处理）引起的hDPCs增殖和分化缺陷。进一步的机制研究通过染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶报告基因实验证实，STAT3能够直接结合到WNT2B的启动子区域，并激活其转录。这表明STAT3通过直接转录激活WNT2B，进而调控经典的Wnt/β-catenin信号通路，从而驱动成牙本质细胞分化。

本研究通过整合“从预测到验证”的策略，首次系统性地确立了STAT3在牙本质发生中的核心调控作用。研究不仅利用单细胞转录组学和计算生物学方法（CellRank、SCENIC、CellOracle）前瞻性地将STAT3鉴定为关键调控因子，还通过体外细胞模型（shRNA敲低、药理学调控）和体内条件性基因敲除小鼠模型，从功能上证实了STAT3对于成牙本质细胞分化和牙本质形成的不可或缺性。更重要的是，研究深入揭示了其作用机制：STAT3通过直接结合并转录激活WNT2B基因，从而启动经典的Wnt/β-catenin信号通路，最终驱动成牙本质细胞的分化程序。

这项研究的结论具有重要的科学意义和潜在的应用价值。在科学上，它深化了我们对牙本质发育复杂转录调控网络的理解，将STAT3-WNT2B-β-catenin轴确立为一条新的关键信号通路。STAT3条件性敲除小鼠所表现的牙本质薄、牙根短、萌出迟等表型，与临床牙本质发育不良（Dentin Dysplasia）的症状高度相似，提示STAT3可能是该疾病的候选致病基因或调控节点，为相关疾病的分子诊断提供了新线索。在应用层面，研究证明STAT3的活性可以被小分子药物（如AG490、colivelin）调控，并影响牙源性细胞的命运，这为开发针对牙本质发育障碍或促进牙本质再生的新型治疗策略（例如靶向STAT3或WNT2B的药理学干预）提供了重要的理论依据和潜在的靶点。此外，本研究展示的整合计算预测与多层次实验验证的研究范式，也为其他复杂发育和再生过程的关键基因发现与功能解析提供了高效的方法学参考。该研究成果已发表在《Cell Proliferation》期刊上。