《Methods》：CST-Based Molecular Profiling of Vaginal Microbiota Validated by qRT-PCR and 16S Amplicon Sequencing
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阴道微生物群通过qRT-PCR技术实现高效检测与诊断，其与16S测序结果高度一致，验证了qRT-PCR在精准评估阴道菌群平衡中的快速、低成本优势。
李恩惠（Eunhye Lee）|韩圭东（Kyudong Han）|文世荣（Seyoung Mun）
韩国全罗北道天安市 Dankook 大学生物融合学院微生物学系，邮编 31116
摘要
阴道微生物组通常根据乳酸菌（Lactobacillus）的种类优势及其相对丰度被划分为五种群落状态类型（Community State Types, CSTs）。乳酸菌通过产生乳酸和过氧化氢在维持阴道微生态平衡中起着核心作用。乳酸菌种类的破坏或减少会导致阴道pH值升高，从而促进与细菌性阴道病（BV）相关的厌氧菌过度生长。尽管基于下一代测序（NGS）的微生物组分析已被广泛用于描述阴道微生物群落，但其临床应用仍受到高成本、长分析周期以及无法快速、特异性定量等限制。在本研究中，我们开发并验证了针对四种与健康相关的乳酸菌种类（Lactobacillus crispatus、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus iners 和 Lactobacillus jensenii）以及四种与细菌性阴道病相关的细菌类群（Atopobium vaginae、Clostridiales genomosp BVAB1、Prevotella bivia 和 Megasphaera type 1）的特异性定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）引物对。通过将qRT-PCR获得的定量结果与基于16S rRNA基因V3–V4测序的相对丰度数据进行系统比较，发现两种方法在识别关键阴道微生物特征方面具有高度一致性。这些发现共同表明，qRT-PCR是一种快速、经济且敏感的方法，适用于阴道微生物组的评估，并支持其作为分子诊断工具用于精确检测阴道微生物群失衡的潜力。
引言
微生物组是指在特定环境或生物体内发现的所有微生物及其遗传信息的总和，包括细菌、病毒、真菌和古菌。人类微生物组已成为一个重要的研究领域，身体各部位的微生物群通过与其宿主的复杂相互作用影响健康和疾病。这些微生物组在基因组层面被研究，它们通过与宿主的共生关系执行多种生理功能，如免疫调节、病原体防护和营养物质处理。
微生物组研究进展迅速，尤其是在肠道领域，但阴道微生物组的研究仍相对不足。阴道微生物组对女性生殖健康尤为重要。它不仅仅是月经分泌物的通道，还对其自身及新生儿产生深远影响。阴道环境可影响生育能力、母亲健康以及感染性传播疾病（如HIV）的风险。阴道微生物组环境被分为五种群落状态类型（CSTs）（图1），这些类型用于预测和诊断女性生殖系统健康状况。CST I – Lactobacillus crispatus，CST II – Lactobacillus gasseri，CST III – Lactobacillus iners，CST V – Lactobacillus jensenii；CST IV进一步细分为CST IV-A和CST IV-B。这些类型也被称为多样性组，意味着它们不富含乳酸菌。类型A指的是乳酸菌 iners和其他厌氧菌共存的环境；类型B则是以可能导致细菌性阴道病的细菌为主导的环境[1],[2],[3]。
在健康状态下，阴道主要由乳酸菌占据主导地位，它们产生乳酸和H?O?等物质来降低阴道pH值并抑制病原微生物的生长[4]。然而，当这种平衡被打破时，机会性细菌会引起细菌性阴道病（BV）等状况，这与阴道微生物组的改变有关。BV是女性中常见的阴道疾病，其特征是健康的阴道微生物群被与BV相关的细菌所取代。这些细菌会引起包括异味和异常阴道分泌物在内的临床症状。此外，先前的研究表明，BV与不良的生殖和健康结果相关，如流产、早产以及性传播感染的风险增加[5],[6],[7]。目前最常用的BV诊断方法是基于“Amsel标准”和“Nugent评分”的显微镜检查，但显微镜检查具有高度主观性，且在准确区分细菌种类方面能力有限[8]。
在这方面，分子生物学分析技术被用于研究阴道微生物组。虽然过去曾使用基于下一代测序（NGS）的分子诊断技术，但该方法耗时且成本高昂。此外，对于阴道微生物而言，NGS主要分析样本中的所有细菌，因此难以仅检测目标微生物，尤其是在物种水平上[9]。然而，基于qRT-PCR的分子诊断技术可以有效检测目标微生物，并通过定量分析确定样本中目标细菌的数量是高还是低[10]。更重要的是，该方法可以针对特定菌株进行检测，相比NGS成本更低、耗时更少[9]。先前的研究比较了仅占肠道微生物组一小部分的菌株的NGS和qRT-PCR数据，发现两者之间存在统计学上的显著相关性[9]。
在本研究中，我们采用了整合的宏基因组-靶向定量策略来分析阴道微生物组（图2）。首先使用16S rRNA基因V3–V4区域测序来表征微生物群落，从而识别关键阴道微生物。根据测序结果，我们设计并验证了针对主要有益乳酸菌种类（Lactobacillus crispatus、L. gasseri、L. iners 和 L. jensenii）以及代表性细菌性阴道病（BV）相关菌群（Atopobium vaginae、Clostridiales genomosp BVAB1、Prevotella bivia 和 Megasphaera type 1）的特异性qRT-PCR引物对。通过将qRT-PCR获得的定量数据与基于NGS的定量结果进行系统比较，本研究证明了qRT-PCR作为快速、经济有效的分子工具在阴道微生物组评估中的分析一致性和诊断潜力，以及其在靶向临床诊断中的应用价值。
实验流程和16S测序数据处理
在本研究中，我们分析了来自20名韩国女性的阴道样本中的细菌组成（图2）。从20个样本中提取了微生物基因组DNA，并同时检查了DNA的质量（包括浓度和纯度）以及宏基因组分析的准确性。为了确定每个样本的细菌组成，使用20个样本成功制备了Illumina 16S V3-V4短读长扩增子测序文库。基于NGS的16S宏基因组测序被应用于...
讨论
本研究使用基于NGS的定量方法和实时定量PCR（qRT-PCR）来评估这两种定量技术之间的关系。共选择了8种细菌进行qRT-PCR分析，包括4种有益的阴道乳酸菌和4种与细菌性阴道病（BV）相关的病原菌。平行比较显示大多数目标物种的相对比例模式高度一致。
资助信息
无。
伦理批准
本研究中的所有临床实验均遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行，并获得了Dankook大学医院伦理审查委员会（IRB）的批准（IRB协议编号DKUH 2024–08–025）。
伦理声明
所有参与者在参与研究前均签署了书面知情同意书。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了Dankook大学2023年研究基金的支持。
