《Microchemical Journal》：One-pot assay integrating TdT-mediated poly-A tailing with CRISPR-Cas12a trans-cleavage for amplified detection of sperm DNA damage
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本研究开发了一种基于TdT-CRISPR/Cas12a级联放大的单一步骤检测平台，可同时绝对定量精子DNA断裂（MDB）和AP位点，灵敏度达3.6 pM和13 pM，重复性良好（RSD≤7.04%）。临床验证表明，MDB和AP升高与哮喘细胞减少症及反复流产相关，联合指标预测反复流产的AUC为0.8883，为男性不育和反复妊娠丢失提供精准诊断工具。
刘子扬|陈勇|王照阳|张帆|裴立国|周月|王红红|马亮红|严蓓|王娟
教育部重点实验室（生育力保存与维护），宁夏医科大学，人类精子库，医学科学研究所，宁夏医科大学总医院，银川750004，中国
摘要
全球男性生育力的下降构成了一个严重的公共卫生挑战。目前用于评估精子DNA片段化的方法仅提供半定量百分比数据，无法同时检测如碱基缺失/碱基置换（AP）位点等损伤，并且涉及复杂且需要主观解释的程序。为了解决这些限制，我们开发了一种基于dTdT-CRISPR/Cas12a级联扩增的一锅检测平台。该系统能够同时实现对DNA链断裂和AP位点的绝对定量，灵敏度达到pM级别（断裂为3.6 pM，AP位点为13 pM），重复性表现良好（RSD ≤ 7.04%），回收率为95.7–98.1%。临床验证显示，患有弱精症或反复流产的患者的DNA损伤标志物升高。结合MDB和AP指数的方法在预测反复流产方面表现出较好的性能（AUC = 0.8883），优于传统的DFI和单参数指标。这一平台将精子DNA损伤评估从半定量提升到了绝对分子定量，并能够在60分钟的工作流程中同步测量多种类型的损伤，消除了中间步骤。我们的方法为男性不育和反复妊娠丢失的机制研究和临床诊断提供了工具。
引言
全球男性生育力的下降已成为一个严重的公共卫生问题，这凸显了精确评估男性生殖健康的迫切需求[1]，[2]。传统的精液分析主要关注精子形态和活动力等基本参数，但这些指标无法全面反映精子遗传物质的完整性。实际上，精子DNA的完整性不仅是成功受精的关键因素，还直接影响胚胎发育和后代的长期健康[3]，[4]，[5]，[6]，[7]，[8]，[9]。最近的研究表明，精子DNA损伤与男性不育、反复妊娠丢失以及后代先天异常等临床问题密切相关[10]，[11]，[12]，这凸显了建立准确和全面的DNA损伤评估系统的重要性。
目前，用于评估精子DNA损伤的临床方法——包括精子染色质分散试验、精子染色质结构分析、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）和彗星试验——通常受到主观操作、对专用设备的高度依赖性或只能检测一种类型DNA损伤的限制[11]，[13]，[14]，[15]，[16]。更重要的是，广泛使用的DNA片段化指数（DFI）仅提供半定量百分比结果，无法实现DNA断裂的绝对分子定量，也无法同时检测关键的次级损伤如碱基缺失/碱基置换（AP）位点[17]。这些限制严重限制了其在精确诊断和机制研究中的应用价值。
为了解决这些技术瓶颈，我们在之前开发的dTdT链置换探针系统[18]的基础上，创新性地结合了CRISPR-Cas12a系统，构建了一个级联信号扩增的一锅检测平台。
目前，很少有生物传感策略能够同时检测多种类型的精子DNA损伤。大多数现有方法要么专注于DNA链断裂[19]，[20]，要么仅关注AP位点[21]，而且几乎没有一种方法是专门为临床精子样本优化的。多步骤操作通常耗时且容易丢失样本。为了解决这些问题，我们将dTdT介导的多聚A尾添加和CRISPR-Cas12a切割活性整合到一个一锅系统中。这种设计实现了高效级联扩增，显著提高了检测灵敏度，并能够在不进行中间洗涤或纯化的情况下同时实现DNA链断裂和AP位点的绝对定量，这对临床转化应用非常有利。
在这个平台上，内切酶IV特异性识别并切割DNA碱基空位以生成3′-羟基[22]，[23]，[24]，从而引发dTdT介导的多聚A延伸。生成的多聚A链随后被CRISPR-Cas12a/crRNA复合物特异性识别，触发向荧光报告分子的显著切割活性。一锅格式避免了多步骤操作，提高了稳定性，并大大增强了检测效率。所开发的生物传感平台能够在分子水平上同时和绝对定量地检测人类精子中的DNA链断裂（MDB）和AP位点。这种方法不仅克服了传统DFI的半定量限制，还为探索DNA损伤机制提供了多维工具。凭借其有前景的临床转化潜力，该方法为评估弱精症、反复妊娠丢失和其他男性生殖障碍提供了新的方法，支持了精确的男性生殖健康管理的发展。
研究队列和临床样本
精液样本来自宁夏医科大学总医院和银川市妇幼保健院的生殖医学中心。所有参与者均提供了书面知情同意书，研究方案已获得机构伦理委员会的批准（批准编号KYLL-2024-0351）。研究对象分为四组：（1）正常精子组（n = 20）：参与者的精液参数符合世界卫生组织的标准
CRISPR-TdT生物传感系统检测精子DNA损伤工作原理的验证
本研究成功建立了一个基于CRISPR-TdT级联信号扩增的生物传感系统，用于定量检测精子DNA损伤。该系统通过量化精子DNA中3′-羟基（3’-OH）末端的数量来反映DNA链断裂的程度。由于完整的双链DNA在其末端只有两个3′-OH末端，而人类精子基因组长度约为15亿个碱基对，因此这些自然末端的背景信号贡献
结论
在这项研究中，我们开发了一种基于dTdT-CRISPR级联扩增的生物传感平台，能够同时实现精子DNA中DNA链断裂（MDB）和碱基缺失/碱基置换（AP）位点的绝对定量。临床验证表明，患有弱精症的男性以及反复流产女性伴侣的精子DNA损伤负担（MDB和AP）较高。结合MDB和AP指数的方法在预测反复流产方面的AUC为0.8883。通过实现
CRediT作者贡献声明
刘子扬：撰写——原始草稿，数据整理。陈勇：撰写——原始草稿，数据整理。王照阳：撰写——原始草稿，数据整理。张帆：资源提供，数据整理。裴立国：资源提供。周月：数据整理。王红红：方法学设计，数据整理。马亮红：撰写——审稿与编辑。严蓓：撰写——审稿与编辑。王娟：撰写——审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了宁夏医科大学科学研究项目（XZ2024013、XT2025009、XY2025032）、宁夏卫生健康委员会项目（2024-NWZD-A001、2024-NWQP-B081）、宁夏回族自治区重点研发计划（2025BEH04073）、宁夏医科大学的本科生成才创新创业培训计划（NYCXCYX056）、国家自然科学基金（82460295）的支持。
