SDA介导的高灵敏度视觉CRISPR/Cas12a检测平台，用于即时检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）

《Microchemical Journal》：SDA-mediated high-sensitivity visual CRISPR/Cas12a detection platform for point-of-care detection of MRSA

该研究开发了一种基于CRISPR/Cas12a、SDA和DNA-AuNPs的可视化POCT平台，通过颜色变化（红/紫）快速检测MRSA。灵敏度达5 cfu/mL，与qPCR相当，无需复杂仪器。

　　

董文佳|吴晓燕|李洪生|于俊杰|徐思琪|蒋雅云

浙江省嘉兴市南湖区环城北路1518号嘉兴市第二医院临床实验室，314000

摘要

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染发展迅速，对患者健康构成重大威胁。基于培养的药物敏感性检测和核酸扩增方法耗时且复杂，需要专门的仪器和技术人员。为了解决这些限制，我们提出了一种新型的、肉眼可见的POCT（即时检测）平台用于MRSA检测。该可视化方法利用CRISPR/Cas12a准确识别目标基因，切割链置换扩增（SDA）模板，并调控DNA功能化金纳米颗粒（AuNP）的聚集，由此产生的颜色变化作为信号（CaSD@Au）。目标基因的存在激活CRISPR/Cas12a的酶活性，从而切割SDA模板。这种切割抑制了SDA反应，防止了DNA-AuNP的聚集，保持了纳米颗粒的分散状态，从而呈现可见的红色。在没有目标基因的情况下，SDA反应进行，金纳米颗粒聚集，变为紫色。敏感性分析证实，CaSD@Au的检测限为5 cfu/mL^?1

引言

抗生素耐药性是一个全球性的公共卫生威胁，也是传染病相关死亡的重要原因[1]、[2]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）由于其高流行率和严重的医疗影响，被列入2024年世界卫生组织细菌优先病原体名单。一种易于使用、高度敏感的诊断方法可以实现早期干预，指导针对性治疗，并有助于减少抗菌药物耐药性[3]。然而，传统的检测方法（如基于培养的药物敏感性检测和聚合酶链反应（PCR）需要复杂的设备和专业人员，限制了其在即时检测（POCT）中的应用[4]、[5]。因此，开发灵敏且便捷的MRSA检测方法对于早期预防、针对性治疗和公共卫生保护至关重要。

规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关（Cas）系统是细菌的一种适应性免疫机制，可用于防御病毒病原体[6]。该系统最初由Ishino等人在研究大肠杆菌碱性磷酸酶同工酶转化中的iap基因调控时发现[7]。后续研究将CRISPR的应用扩展到基因编辑和分子检测[8]、[9]。关键的发展包括CRISPR/Cas12和Cas13，它们对单链DNA（ssDNA）和RNA具有非特异性切割活性，显著增强了核酸检测能力[10]、[11]。CRISPR/Cas12与crRNA结合后，可靶向并切割含有T-rich PAM基序（TTTN）的双链DNA（dsDNA），并对ssDNA进行PAM独立的切割[10]。这些特性支持了基于CRISPR/Cas12的多种核酸检测平台的发展[2]、[12]。

在检测应用中，CRISPR技术通常与核酸扩增方法结合使用以提高灵敏度[13]、[14]。常用的方法包括PCR和多种等温扩增方法[15]、[16]、[17]。其中，后者因其高效性和便捷性而受到大多数研究人员的青睐[18]、[19]。重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种体外开发的等温扩增技术，模拟体内的核酸复制过程。它使用重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶[20]。RPA具有高灵敏度和简单操作性，但容易发生非特异性扩增，可能导致假阳性结果[21]。为了解决这一问题，我们引入了CRISPR/Cas12a系统，该系统具有高序列特异性，减少了非特异性扩增产物的干扰[22]。CRISPR/Cas12a与RPA的结合已被证明非常可靠[23]。然而，大多数现有研究依赖荧光探针进行信号输出，这需要专门的荧光检测仪器，限制了其在POCT中的适用性。为了实现无仪器的可视化检测并进一步提高灵敏度，我们将CRISPR/Cas12a的切割反应与链置换扩增-金纳米颗粒（SDA-AuNP）比色读数相结合。SDA是一种等温核酸扩增技术，可在恒定温度下快速扩增目标物质，具有广泛的核酸检测潜力[24]、[25]、[26]。Feng等人开发了一种通过目标触发的SDA将miRNA转化为dsDNA的可视化方法，激活CRISPR/Cas12a的切割反应并释放胰蛋白酶，胰蛋白酶水解明胶，增加滤纸的通透性，在棉线上产生可见的距离信号[27]。Wang等人开发了一种基于miRNA-21触发的SDA反应的可视化生物传感器，激活Cas12a，切割磁珠和纳米酶之间的单链DNA连接器，释放纳米酶以催化比色反应[28]。然而，在上述所有方法中，SDA都作为目标的预扩增步骤，这对SDA反应的特异性要求很高。此外，SDA的启动效率高度依赖于目标浓度。低丰度目标可能无法有效触发扩增，从而限制了检测灵敏度和可靠性。将SDA-AuNP比色读数策略与RPA和CRISPR/Cas12结合使用可以有效解决这一问题。RPA-CRISPR/Cas12a系统的引入提高了方法的灵敏度和特异性，同时具有操作简单、无需额外仪器的优势。

金纳米颗粒（AuNPs）是生物传感技术中常用的纳米材料[29]。AuNPs具有优异的消光系数和距离依赖性光学特性，可用作生物医学和化学分析中的比色指示剂[30]。AuNPs在分散状态和聚集状态之间表现出明显的颜色变化，这些变化肉眼可轻易检测到[31]。诱导AuNP聚集的常用方法是核酸杂交。Satoh等人用两种不同的单链DNA片段对AuNPs进行了功能化处理。在互补核酸片段存在的情况下，DNA-AuNP聚集，导致颜色变化。这建立了一种简单、快速、灵敏且高效的病原体检测方法。该方法的可检测灵敏度达到10²拷贝/mL^?1[32]。利用AuNPs的特性，SDA技术经常与AuNPs结合使用，以提高灵敏度和实用性[33]、[34]、[35]。

在此，我们开发了一种新型的、肉眼可见的POCT平台（CaSD@Au），利用CRISPR/Cas12a准确识别目标基因，切割SDA模板，并控制DNA-AuNPs的聚集。CRISPR/Cas12a作为特定细菌检测的识别元件，SDA扩增信号以提高灵敏度，DNA-AuNPs作为比色系统用于可视化。具体而言，目标基因激活Cas12a的切割活性，非特异性切割SDA模板的单链区域，从而抑制SDA反应并减少DNA-AuNPs的聚集，导致可见的颜色变化。因此，我们建立了一种基于CRISPR/Cas12a-SDA的可视化细菌检测方法。使用MRSA作为模型耐药细菌，该平台展示了令人满意的特异性和灵敏度。从临床样本中分离出MRSA也验证了该平台的实际应用性。

材料与方法

• 2.1
  材料与试剂

氯金酸购自Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。蛋白胨购自Haibo Biotechnology Co., Ltd.（中国青岛）。Bst 3.0 DNA聚合酶、Nt.Bbv CI切接内切酶和LbCas12a购自New England Biolabs Inc.（美国NEB）。RPA核酸扩增试剂盒购自Qitian Gene Biological Co., Ltd.（中国江苏）。Premix Teq（dNTP混合物和Ex Taq? DNA聚合酶）购自Takara

CaSD@au平台原理

本研究基于CRISPR/Cas12a系统和SDA产物诱导的DNA-AuNP聚集构建了一个可视化平台。SDA模板是关键组成部分，它将CRISPR/Cas12a系统与DNA-AuNP聚集产生的信号联系起来。如图1所示，当没有目标基因存在时，Cas12a/crRNA复合物保持不活跃状态，允许SDA反应进行并生成大量称为Linkers的单链DNA。Linkers的两端分别与DNA1和DNA2互补

结论

总之，我们开发了CaSD@Au，这是一种通过调控DNA-AuNPs聚集来产生颜色变化的SDA控制比色平台。该传感器整合了RPA、SDA和Cas12a的三重扩增效应，表现出高灵敏度。当目标基因存在时，DNA-AuNPs保持不聚集状态，溶液保持红色并产生比色信号。该平台结合了CRISPR/Cas12a的精确靶向能力和可视化读数解析

CRediT作者贡献声明

董文佳：撰写——原始草稿、软件、方法学、数据管理。吴晓燕：撰写——审稿与编辑、验证、数据管理。李洪生：撰写——审稿与编辑、方法学、研究、数据分析。于俊杰：撰写——审稿与编辑、验证、软件、数据管理。徐思琪：撰写——审稿与编辑、验证、资源获取、资金申请。蒋雅云：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、软件、方法学、资金申请。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了嘉兴市科学技术计划项目（2024AD30077和2025CGW105）和德阳市关键研发指导项目（2024SZY001）的支持。