《Epilepsia》：Biofluid-specific variations in circulating 5′ transfer RNA fragments during ictal and interictal states in experimental temporal lobe epilepsy
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本研究探讨了颞叶癫痫(TLE)患者和模型大鼠体内两种5′转运RNA片段(tRF)的生物流体特异性动态变化，旨在寻找可靠的生物标志物。研究人员在大鼠癫痫模型中纵向采集脑脊液(CSF)和血浆样本，结合连续脑电图(EEG)监测，发现血浆中5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC水平在癫痫状态下显著升高，而CSF中Gly-GCC水平与发作间期尖波(IS)活动相关。该研究结果表明，不同的生物流体(血浆和脑脊液)反映了不同的疾病状态信息，为癫痫的诊断和状态监测提供了新的、可及的生物标志物。
癫痫，作为一种以反复发作为特征的神经系统疾病，影响着全球数千万人。其中，颞叶癫痫(Temporal Lobe Epilepsy, TLE)是成人中最常见且治疗抵抗的局灶性癫痫形式。对于临床医生、患者及其照护者而言，能够通过简单、微创的方法（如血液检测）获得生物标志物，对于辅助癫痫诊断，甚至预测癫痫发作，具有巨大的价值。近年来，循环中小型非编码RNA(sncRNAs)因其在血液(血清、血浆)和脑脊液(Cerebrospinal Fluid, CSF)等所有生物流体中均能检测到的特性，成为探索癫痫生物标志物的热点分子。其中，转运RNA片段(transfer RNA fragments, tRFs)是一类由转运RNA(tRNA)酶切产生的sncRNAs，在血液中表现出高度稳定性，是很有潜力的无创生物标志物候选者。然而，在预测癫痫发作风险方面，哪种生物流体(CSF还是血浆/血清)是检测其水平的最优来源？这些分子信号的生物流体特异性如何？它们反映的是发作前状态、发作间期还是发作后状态？这些问题都亟待解答。
为了填补这些知识空白，研究人员在锂-毛果芸香碱诱导的大鼠TLE模型中，对两种先前在人类癫痫患者中显示出潜力的5′tRFs——5′tRF Glu-CTC和5′tRF Gly-GCC，在血浆和CSF中的水平进行了纵向动态分析，并结合连续脑电图监测，探究其水平与电生理活动之间的相关性。该研究最终揭示了生物流体隔室在反映癫痫状态方面所承载的不同信息，为我们理解这些信号的来源及其作为癫痫生物标志物的实际应用价值提供了重要见解。相关论文发表在癫痫学领域知名期刊《Epilepsia》上。
在研究方法上，本研究采用了动物模型与人类样本验证相结合的策略。核心方法包括：在大鼠TLE模型慢性期，通过小脑延髓池和尾静脉进行纵向CSF和血液采样。通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)技术，使用定制设计的TaqMan引物，对血浆和CSF样本中的目标5′tRF水平进行定量。研究期间对大鼠进行了视频和视频脑电图监测，以记录自发性反复发作(spontaneous recurrent seizures, SRSs)和发作间期尖波(interictal spikes, ISs)活动，并将生物标志物水平与电生理事件相关联。此外，研究还利用已建立的生物信息学流程tsRNAsearch，对来自人类TLE患者和健康对照者的血浆及CSF样本进行小RNA测序(small RNA-seq)分析，以验证动物实验的发现。在统计分析方面，除了常规的Mann-Whitney检验、方差分析等，还采用了受试者工作特征曲线(Receiver Operator Characteristic, ROC)分析来评估生物标志物的诊断效能，并使用线性混合效应模型来考虑动物内的重复测量。
3.1 颞叶癫痫大鼠的自发性发作和IS活动
研究人员首先确认了模型动物的癫痫发展特征。在慢性期，大鼠表现出了进展性疾病特征，自发性全身性运动性发作频率在后期显著增加。同时，通过视频脑电图记录，也监测到了非运动性发作和发作间期尖波活动。这为后续将生物标志物水平与不同的电生理状态（发作期与发作间期）相关联奠定了基础。
3.2 对TLE大鼠CSF和血浆中5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC的定量分析
研究人员比较了癫痫大鼠与对照组大鼠在CSF和血浆中两种5′tRF的水平。结果显示，在癫痫大鼠的血浆中，5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC的水平均显著高于对照组，其诊断区分能力很高（ROC曲线下面积Area Under the Curve, AUC分别达到0.96和0.97）。相反，在CSF样本中，癫痫组与对照组的tRF水平仅略有升高，但差异不显著，其诊断区分能力也较弱。这表明，在慢性癫痫状态下，这两种5′tRF的水平升高主要发生在血浆中，而非CSF。
3.3 发作期癫痫样活动与大鼠生物流体中5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC水平的相关性
为了探究tRF水平是否随近期发作活动而变化，研究人员根据采样前后24小时内是否发生癫痫发作，对样本进行了分组分析。结果显示，无论是在采样前24小时内、采样后24小时内发生过癫痫发作，还是在采样前后24小时内均无发作的癫痫大鼠，其血浆中两种5′tRF的水平均显著高于对照组，但不同分组间（即有或无近期发作）的tRF水平并无显著差异。CSF中的tRF水平在各组间也未显示显著变化。这些数据表明，血浆中5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC水平的升高与已确立的癫痫状态相关，但不会因个体自发性癫痫发作的发生而出现显著波动。
3.4 IS活动与大鼠TLE中5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC水平的相关性
接下来，研究人员探究了tRF水平是否与发作间期尖波活动相关。他们根据采样前后2小时内是否出现IS活动对动物进行分组。结果显示，癫痫大鼠的血浆tRF水平在所有分组中均显著升高，且与IS活动的时间临近性无关。与此形成鲜明对比的是，在CSF中，5′tRF Gly-GCC的水平在采样前或采样后出现IS活动的组别中显著升高，但在采样前后均未观察到IS活动的组别中则没有升高。5′tRF Glu-CTC在CSF中也显示出相似但不显著的趋势。这表明，血浆tRF水平的升高与癫痫状态本身相关，而不随IS活动的发生而显著波动；而CSF中5′tRF Gly-GCC的水平则特异性地在IS活动期间升高。
3.5 人类TLE患者血浆中5′tRF水平高于CSF
为了验证动物实验的发现，研究人员分析了人类TLE患者和对照组血浆与CSF样本的小RNA测序数据。结果与动物实验高度一致：在人类TLE患者的血浆中，5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC的读段数均高于健康对照组；而在CSF中，这两种片段的水平极低，且在患者与对照组之间没有差异。这进一步证实，5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC的升高主要存在于血浆中，而非CSF。
本研究的主要结论是，在实验性颞叶癫痫大鼠和人类TLE患者中，血浆中的5′tRF Glu-CTC和Gly-GCC水平均显著升高，可作为潜在的、易于获取的癫痫诊断生物标志物。然而，血浆中的tRF水平虽然能可靠地指示潜在的癫痫状态，却无法区分近期是否发生过癫痫发作或IS活动。有趣的是，CSF中的5′tRF Gly-GCC水平被发现与IS活动特异性相关，这提示CSF tRF水平可能动态反映了大脑网络的即时高兴奋性状态。这一发现为利用CSF tRF进行患者分层（例如，识别出存在高水平IS活动的患者）提供了可能性，尽管CSF采样更具侵入性。
研究的意义在于，它首次在大鼠TLE模型中验证了人类研究中观察到的血浆5′tRF升高现象，证明了其跨物种保守性，并首次揭示了不同生物流体（血浆 vs. CSF）在反映不同癫痫状态信息（慢性疾病状态 vs. 急性网络高活动性）方面的独特价值。血浆检测提供了一种无创、易于获取的癫痫诊断工具，而CSF检测则可能为监测与认知障碍相关的发作间期活动提供窗口。未来的研究需要进一步探索这些tRFs的产生和释放机制（例如，是否通过细胞外囊泡释放），并明确其组织来源（中枢神经系统还是外周组织），以更深入地理解其作为生物标志物的生物学基础。总之，这项研究为开发基于tRF的、生物流体特异性的癫痫诊断和监测策略迈出了坚实的一步。
