《Plant Direct》：A Fluorescence-Based Transient Expression Assay for the Analysis of Upstream Open Reading Frames in Plants
编辑推荐：
本研究针对现有植物上游开放阅读框（uORF）功能表征方法依赖耗时费力的原生质体制备或底物添加等局限，开发了一种基于mNeonGreen与tdTomato双荧光蛋白共表达的瞬时报告系统，在烟草叶片中实现了对5′前导序列调控作用的高通量、低成本分析。该方法成功鉴定了大豆和豇豆中与光保护相关基因（PsbS、VDE、ZEP）的多个抑制性uORF，为通过基因编辑精细调控内源基因表达、提升作物光合效率提供了新工具。
在作物遗传改良领域，如何在不引入外源转基因的情况下精准调控内源基因的表达水平，一直是研究者们努力的方向。上游开放阅读框（upstream open reading frame, uORF）作为广泛存在于真核生物mRNA 5′前导序列（5′ leader）中的翻译调控元件，为此提供了一种极具潜力的解决方案。uORF能够通过影响核糖体对下游主要开放阅读框（main ORF, mORF）的翻译起始效率，在转录后水平对基因表达进行精细调控。通过基因编辑技术对uORF进行改造，已成为一种上调内源基因表达、进而改良作物性状（如抗性、营养成分含量等）的新策略。然而，尽管已有核糖体图谱等组学技术可用于在全基因组范围内发现可能被翻译的uORF，但其功能验证仍需依赖于报告基因检测和突变研究等实验手段。当前在植物中常用的筛选方法，例如基于荧光素酶的报告系统或原生质体转化，通常需要复杂的组织处理或添加底物，限制了其通量和便捷性。因此，开发一种更快速、简便且可靠的体内检测方法，对于推动uORF的基础研究与作物育种应用具有重要意义。
为了应对这一挑战，研究人员在《Plant Direct》上发表了一项研究，介绍了一种基于双荧光蛋白的瞬时表达检测方法，用于在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片组织中高效分析5′前导序列及uORF的功能。该方法的核心优势在于将整个工作流程——从载体构建到农杆菌浸润和荧光定量——缩短至两周内完成，且无需制备原生质体或使用化学发光底物，大大提升了筛选效率并降低了成本。
本研究主要应用了以下几项关键技术方法：首先，研究人员设计并构建了一个基于Loop组装和MoClo工具包的双荧光报告载体骨架。该载体包含一个由花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）驱动的实验报告基因mNeonGreen（mNG）和一个由章鱼碱合成酶启动子（OCS）驱动的内参报告基因tdTomato（tdT），以避免重复启动子可能引起的转录干扰。其次，通过农杆菌浸润法（Agroinfiltration）将构建好的载体瞬时转化到本氏烟草叶片中，实现了目标5′前导序列与报告基因在植物组织中的快速共表达。最后，利用多功能酶标板在特定激发/发射波长下（mNeonGreen: 490/520 nm；tdTomato: 540/595 nm）对叶片圆片的荧光强度进行双通道定量测量，并通过比较野生型与突变型5′前导序列的mNG/tdT荧光信号比值，来评估uORF对下游报告基因表达的调控作用。
3.1 mNeonGreen与tdTomato用于双荧光报告系统的适用性
通过将mNeonGreen和tdTomato在本氏烟叶片中单独或共表达，研究人员验证了这两种荧光蛋白在该体系中的适用性。光谱扫描和显微成像结果显示，两者在优化后的检测波长下具有高亮度、快速成熟、背景自发荧光低且通道间串扰最小的特性，非常适合用于共表达和基于酶标板的定量分析。此外，研究人员设计了包含ccdB选择标记的双荧光载体骨架，允许通过单步BpiI酶切连接快速克隆目标5′前导序列，简化了工作流程。
3.2 利用已知功能uORF进行报告系统验证
为验证该方法的有效性，研究选用了已知具有强翻译抑制功能的拟南芥BRI1（AtBRI1）和莴苣GGP2（LsGGP2）基因的5′前导序列进行测试。当通过突变破坏其uORF的起始密码子后，检测到的相对荧光信号比值分别平均增加了近70%和超过160%。这一结果与先前利用荧光素酶报告系统观察到的趋势一致，证明了本报告系统在烟草叶片组织中筛选uORF功能的可靠性。
3.3 在NPQ相关基因中筛选uORF
研究人员将该方法应用于大豆（Glycine max）和豇豆（Vigna unguiculata）中与非光化学猝灭（nonphotochemical quenching, NPQ）机制相关的三个核心基因：PsbS、VDE（violaxanthin de-epoxidase）和ZEP（zeaxanthin epoxidase）。通过对这些基因5′前导序列中预测的uORF候选序列（基于起始密码子类型、Kozak序列上下文和长度）进行起始密码子突变，并测量报告基因表达变化，成功鉴定出多个具有抑制作用的uORF。例如，在大豆GmVDE中，破坏第一个ATG-uORF（GmVDE-aaa1）使信号比值增加了136%；在豇豆VuPsbS中，突变ATG1和TTG3 uORF分别使信号增加了108%和130%。通过RT-qPCR对信号变化最显著的突变体进行转录水平检测，发现大部分突变体的mRNA水平与野生型相比无显著差异，表明观察到的荧光信号变化主要源于翻译水平调控，而非转录改变。
4 讨论与5 结论
本研究成功建立了一套基于双荧光蛋白（mNeonGreen/tdTomato）共表达的、快速、简便的瞬时报告系统，用于在植物体内筛选5′前导序列和uORF的翻译调控功能。该方法避免了原生质体制备和化学发光底物添加，在两周内即可完成从克隆到定量的全流程，为高通量分析提供了新工具。利用该系统，研究人员在大豆和豇豆的光保护相关基因（PsbS、VDE、ZEP）中鉴定出多个具有抑制作用的uORF候选位点，例如GmVDE-ATG1、VuPsbS-ATG1和VuPsbS-TTG3。这些发现不仅揭示了这些基因可能存在的翻译层面调控机制，也为通过基因编辑其uORF来内源上调这些基因的表达、进而可能优化作物的NPQ诱导与松弛动力学、提高光合效率提供了潜在的靶点。尽管本方法的检测灵敏度可能略低于荧光素酶报告系统，但其在操作便捷性、成本和通量上具有明显优势。未来，结合新兴的预测工具（如TISCalling）可更精准地筛选uORF，而本研究鉴定的候选uORF也需在稳定遗传的编辑植株中进行功能验证。总之，该工作扩展了植物uORF功能研究的分子工具集，为通过编辑顺式调控元件实现作物性状的精准改良提供了新的技术路径和思路。
