《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Revealing cooperativity in mixed lipid membranes from their FTIR spectra
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脂质膜中合作单元大小（CUS）的FTIR光谱分析显示，通过监测磷酸盐和甲基链振动特征，可揭示熔化过程的温度范围与DSC测得的CUS数值高度相关，尤其在不饱和脂肪酸（如亚油酸）混合体系中，CUS显著大于饱和脂肪酸（如硬脂酸）体系。
Vedrana Krajnovi?|Antonia Mati?|Barbara Pem|Danijela Bakari?
有机化学与生物化学系，Ru?er Bo?kovi?研究所，Bijeni?ka 54，10000 萨格勒布，克罗地亚
摘要
不同类型脂质在质膜中的定位形成了对细胞分裂和物质运输过程至关重要的结构域。与膜中脂质结构域的概念密切相关的是协同单位大小（CUS）的概念，它指的是能够对相应刺激产生同步响应的一定数量的脂质。通常使用DSC技术来确定（混合）脂膜中单个结构域的CUS，该技术通过观察膜（单个）构建成分在特定温度范围内的相变来实现。本研究引入了温度依赖的FTIR光谱法，以脂质分子的数量而非CUS的大小来表征三元脂质混合物的协同性。通过分析源自磷酸基团和烃链亚甲基基团的振动带，并利用化学计量工具，我们获得了脂质分子极性部分和非极性部分的不同熔化温度。除了重建熔化过程的时间顺序外，熔化出现的温度范围的宽度也与DSC测量得到的CUS结果完美吻合。本文所述的方法为理解混合脂质双层中的协同性提供了新的见解。
引言
质膜对细胞分裂或囊泡介导的物质运输等刺激的及时响应在很大程度上取决于膜脂质的组成及其局部分布[1]、[2]、[3]、[4]。一般来说，膜组成的空间和时间上的异质性与结构域的形成有关[5]、[6]，即膜区域与其周围环境具有不同的性质[7]、[8]。尽管已经通过各种实验和计算技术对结构域的形成机制及其在脂膜内的大小和位置变化进行了研究[9]、[10]、[11]、[12]，但这些机制仍然尚未完全明了[13]。使用显微技术识别结构域时的主要不确定性之一源于难以检测亚微米级的结构域[14]、[15]，而这种不确定性又因结构域的瞬态性质而加剧[5]、[16]。改变其他脂质的相对含量可以影响结构域的大小和物理性质，以及共存结构域的相对数量，即使双层是由结构相似的脂质构成的。例如，尽管1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DPPC）和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DPPG）在较宽的pH值范围内（2 ≤ pH ≤ 12）的头部基团不同且带有不同的电荷[17]，但它们的热致性特性几乎相同：在室温下，这两种脂质都处于凝胶相（Lβ’），其特征是烃链主要以反式构象排列，脂质分子呈三角形晶格结构[18]；约35°C时，两种双层都表现出低协同性的预转变，双层表面出现明显的波动，这被称为波纹相（Pβ’）；进一步加热这两种脂质双层会导致高协同性的主相变，最大转变温度约为41°C，此时处于流体相（Lα）。流体相的显著特征是烃链间的范德华相互作用减弱以及极性头部基团的水合作用增强。由于后者主要表现为左旋构象的增加[18]、[19]，因此流体相最明显的结构特点是双层变薄[20]、[21]。除了结构技术外，FTIR光谱作为一种极其敏感且无需探针的技术，能够基于某些功能基团产生的光谱带最大值的移动来准确记录凝胶相到流体相的转变；在Lα相中，左旋构象数量的突然增加表现为烃链的不对称和对称伸展（νasCH2和νsCH2）产生的光谱带最大值的高频位移[22]、[23]、[24]，同时还伴随着由于Lα相中水合作用增强而引起的羰基和磷酸基团产生的光谱带最大值、形状和/或宽度的变化。尽管DPPC和DPPG的混合几乎理想，但离子的存在和不同的比例可能导致相分离[25]、[26]、[27]，而在以DPPC为主的脂质双层中加入一定比例的DPPG也可能根据脂质的相互比例稳定某些相[28]、[29]、[30]。
质膜中结构域的形成还受到游离脂肪酸（FAs）的影响[31]、[32]，其含量在生理状态和病理状态下会有显著差异[33]、[34]。从结构上看，FAs减少了脂质间的侧向相互作用，从而导致包装缺陷，这些缺陷的特征强烈依赖于FAs的数量以及烃链的长度和（不）饱和度[35]、[36]、[37]。此外，通过改变水环境的pH值还可以进一步调节FAs的（脱）质子化及其在脂膜中的纵向位移[38]、[39]。
虽然这些术语并不完全明确，但在混合脂质膜中结构域的形成与协同性的概念密切相关[40]。协同性是指同时以协调方式经历某种热致性事件的脂质数量[18]，可以通过差示扫描量热法（DSC）来表征与单个相变相关的协同性。作为一种经济、简单且快速的技术，DSC能够即时且明确地揭示特定相变的协同性水平，从而直接提供形成簇或结构域的脂质数量，例如在主相变过程中[41]、[42]、[43]、[44]、[45]。
除了DSC之外，还可以通过其他实验方法来了解协同单位大小（CUS）；例如，Hatta等人通过对由十五烷酸组成的单层施加表面压力来测量其侧向压缩性，从而确定CUS[46]。另一方面，Gliss等人成功地利用中子掠射衍射和原子力显微镜（AFM）成像技术检测了由平均链长为10 nm的PC脂质组成的脂质双层中存在的结构域[47]。虽然使用AFM等显微技术来表征纳米级结构域似乎很有吸引力，但需要记住，样品制备和测量方法在一定程度上会改变结构域的大小和形状，从而不可避免地对得到的CUS结果产生质疑。
由于特定技术在确定CU大小方面的特异性以及不同测量方法带来的不确定性，在本研究中我们首次采用了FTIR光谱法来定义协同性。通过控制混合脂双层中特定脂质的含量以及FAs等化合物的含量，结构域的形成成为必然。因此，我们准备了由DPPC和DPPG脂质组成的双层，其中含有不同饱和度的脂肪酸（如亚油酸（LA）和硬脂酸（SA）。除了收集混合脂双层的DSC曲线并确定相应的CUS外，我们还在预期会发生热致性事件（预转变和主转变）的温度范围内获取了它们的温度依赖FTIR光谱。通过使用多元曲线拟合和进化因子分析（MCR-ALS with EFA）来分析源自极性（磷酸基团）和非极性（亚甲基基团）部分振动的光谱带，我们能够确定熔化过程的时间顺序，这与DSC测量得到的结果完美吻合。此外，我们还证明了协同性不一定与形成簇或结构域的大小有关，它也可以与相对较长分子（如脂质和FAs）表现出响应的温度范围的宽度相关。
部分摘录
DPPC+DPPG多层脂质体（MLVs）的制备（有无脂肪酸（FAs）的情况
多层脂质体（MLVs）由DPPC（白色粉末，纯度≥99%）、DPPG（白色粉末，纯度≥99%）、硬脂酸（SA；白色粉末，纯度≥98.5%）和亚油酸（LA；无色液体，纯度≥99%）制备而成。所有脂质均购自Avanti Polar Lipids公司，FAs购自Sigma-Aldrich公司。每种化合物均溶解在氯仿（CHCl3；无色液体，Carlo Erba）中，配制成质量浓度为γ = 10 mg/mL的储备溶液。
通过DSC测量确定MLVs的CUS：烃链的（不）饱和度会影响CU的大小
含有PC/PG/LA和PC/PG/SA的MLVs的DSC曲线显示了预转变和主转变（图2a和b；DSC曲线以摩尔热容Cp表示）。有趣的是，对于PC/PG/LA混合物，Tp和Tm值通常低于PC/PG/SA混合物，这表明具有饱和烃链的SA稳定了脂质层的凝胶相。另一方面，PG脂质的含量则产生了相反的效果
结论
在这项研究中，我们使用DSC确定了PC/PG/LA和PC/PG/SA形式的MLVs的CUS。正如预期的那样，含有不饱和烃链（LA）的混合物表现出更强的协同性熔化，即同步熔化的脂质数量多于含有SA的混合物。重要的是，来自MCR-ALS with EFA的基于温度依赖FTIR测量的结果清楚地表明了极性和非极性功能基团的响应
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本文得到了克罗地亚科学基金会的支持，项目编号UIP-2020-02-7669。V. K.和D. B.衷心感谢Ru?er Bo?kovi?研究所物理化学系的生物胶体与表面化学实验室以及辐射化学与剂量学实验室的成员，感谢他们提供了Zetasizer Nano ZS（Malvern）设备的使用权限。
