《Collagen and Leather》：Improved mechanical performance and enzymatic stability of crosslinked dry amniotic membrane by spraying
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为解决人羊膜（AM）机械强度低、降解快的临床应用瓶颈，本研究首创了一种喷雾交联技术。研究人员通过喷洒EDC/NHS与氢键补充液（含氧化合物），制备了交联的干态AM。结果表明，该方法显著提高了材料的最大单轴拉伸断裂应力（+156.1%），降低了酶解失重率（从100%降至63.6%），且在增强机械和抗酶解性能的同时，保留了膜再水化后的固有柔韧性，展示了良好的临床应用前景。
在生物医学领域，人类羊膜（Amniotic Membrane, AM）是一种备受瞩目的天然生物材料。它本身富含多种细胞因子和生长因子，具有抗炎、抗粘连、免疫调节和促进组织修复等优良特性，因此在眼科（如角膜修复）、伤口愈合、外科手术（如防止肌腱粘连）、妇科（如治疗宫腔粘连）和口腔医学（如牙周再生）等领域得到了广泛应用。然而，这种材料的广泛应用却面临着两大“先天不足”的挑战：一是其厚度极薄（仅0.02–0.05毫米），机械强度有限，在临床操作和植入过程中极易发生撕裂和损坏，限制了其在大面积组织修复中的应用；二是其未经化学交联处理的羊膜在体内会快速被酶降解，通常在约一周内就会分解，无法为组织再生提供足够长时间的支撑。尽管传统的化学交联方法（如戊二醛、京尼平等浸泡处理）能在一定程度上增强羊膜的性能，但这些方法通常需要将羊膜长时间浸泡在交联剂溶液中，不可避免地导致材料中水溶性总蛋白的大量流失，削弱了其生物活性。此外，传统的冷冻干燥保存法虽便于储存，却会增加组织的脆性，显著降低其机械强度。那么，有没有一种方法，能够“鱼与熊掌兼得”，即在显著提升羊膜力学性能和抗降解能力的同时，最大程度地保留其宝贵的生物活性成分和固有的柔韧性呢？发表于《Collagen and Leather》的一项研究，为我们带来了一种创新性的解决方案——喷雾交联技术。
为了评估这一新型喷雾交联技术的效果，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，他们建立了喷雾交联的制备工艺，通过精细喷嘴将EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）/NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）混合溶液与氢键补充液（甘油/乙醇混合物）依次喷洒到张力板固定的人羊膜（AM）或成分结构相似的猪肠衣（PI）替代样本上，自然风干后制成交联干膜。其次，通过BCA蛋白定量法和紫外分光光度法，分别测定了水溶性总蛋白的保留量和EDC/NHS交联剂的残留量。再者，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了交联后材料中化学键（如C-N键）的形成。材料的机械性能通过单轴拉伸测试和缝线拉拔测试进行量化。酶解降解实验（使用胃蛋白酶）用于评估材料的抗降解能力。最后，通过细胞毒性测试（CCK-8法）、材料接触溶血率测试、血液吸附实验（包括全血、红细胞和血小板粘附的SEM观察及LDH定量）以及小鼠皮下植入实验（结合Masson染色和CD68免疫组化），系统评估了材料的生物相容性、血液相容性和体内降解行为。
研究结果
3.1 水溶性总蛋白含量
通过BCA法测定发现，喷雾交联的AM样品（EDC-AM-S）中水溶性总蛋白的保留量显著高于相同浓度下浸泡交联的样品（EDC-AM-I）。这表明喷雾法能更有效地减少羊膜在交联过程中活性蛋白成分的流失。
3.2 EDC和NHS残留量的测定
测量结果显示，在相同的交联剂浓度下，喷雾交联样品中残留的EDC和NHS量均远低于浸泡交联样品。这说明喷雾法能使交联剂更充分地参与反应，减少了潜在毒性试剂的残留。
3.3 酶解降解表征
胃蛋白酶降解实验表明，随着EDC/NHS用量的增加，喷雾交联AM和PI样品的失重率显著下降。特别是用30 mM EDC交联的样品，其抗酶解降解性能得到显著改善，证明交联有效保护了细胞外基质。
3.4 DRIFTS-FTIR光谱
FTIR光谱显示，喷雾交联的PI样品（EDC-PI-S）在1206 cm?1处出现了一个明显的C-N键伸缩振动吸收峰，而未交联的新鲜样品（Fresh-PI）在此处无此峰。这直接证实了EDC介导的共价交联反应成功发生，形成了新的酰胺键。
3.5 单轴拉伸测试和缝线拉拔测试
力学测试表明，喷雾交联的AM样品（EDC-AM-S）具有最高的单轴拉伸强度（3.15 ± 0.27 MPa），相较于未处理的新鲜AM（NG-Fresh-AM）提升了约156.1%。同时，氢键补充液处理能在干燥过程中保护羊膜的机械性能，而EDC/NHS交联则进一步大幅增强了材料的强度。缝线拉拔测试也显示，交联后样品能承受的拉出应力显著增加。
3.6 细胞毒性测试
用喷雾交联和浸泡交联的PI样品浸提液培养人胚胎肾293T细胞，CCK-8检测结果显示，两组细胞的存活率与新鲜样品对照组无显著差异，均保持在较高水平（>77%）。这表明EDC/NHS交联系统未引起明显的细胞毒性。
3.7 材料接触溶血率测试
EDC-PI-S样品的溶血率仅为0.82% ± 0.81%，远低于国际标准ISO 10993-1规定的安全阈值（2%），表明该材料具有优异的血液相容性。
3.8 血液吸附实验
扫描电镜观察和乳酸脱氢酶（LDH）定量分析表明，与未交联的新鲜PI样品相比，EDC-PI-S样品表面粘附的血小板、全血细胞和红细胞数量都显著减少，且红细胞大多保持正常的双凹圆盘形态，进一步证明了其良好的抗凝血性能和血液相容性。
3.9 小鼠皮下植入实验
植入小鼠皮下3天后，EDC-PI-S样品的降解程度明显低于Fresh-PI样品。Masson染色显示交联样品胶原纤维结构完整，而新鲜样品则出现多处断裂。CD68免疫组化染色显示，新鲜样品周围聚集了更多的CD68阳性巨噬细胞，表明引起了更强的炎症反应，而交联样品周围的炎症反应较轻。
结论与讨论
本研究成功开发了一种用于制备干态人羊膜的喷雾交联技术，通过“共价键网络增强-氢键保护-活性成分保留”的协同策略，有效解决了传统羊膜制备方法中机械强度差、降解速度快以及水溶性总蛋白难以保留的难题。该技术的创新之处在于：1）通过喷雾方式使交联剂更均匀地渗透并反应，减少了蛋白流失和化学试剂残留；2）利用甘油/乙醇混合液作为氢键补充剂，在干燥过程中替代水分子维持氢键网络，从而保留了材料再水化后的柔韧性；3）制备的干态羊膜可在室温下储存，且力学性能与湿态膜相当。
研究结果表明，喷雾交联使羊膜的最大单轴拉伸断裂应力提升了156.1%，酶解24小时的失重率从100%降至63.6%。在生物安全性方面，材料展现出低细胞毒性、低溶血率以及优异的抗血小板和血细胞粘附性能，小鼠体内实验也证实其降解更慢且引发的炎症反应更轻。这些综合优势表明，喷雾交联技术能够在不牺牲生物相容性和柔韧性的前提下，显著提升羊膜的机械性能和稳定性。
尽管该研究在部分实验中使用了猪肠衣作为替代材料，且对免疫反应的评估集中于巨噬细胞，但其系统性的实验结果充分证明了喷雾交联策略的有效性和先进性。这项工作为开发兼具高力学强度、可控降解速率和良好生物活性的羊膜基生物材料提供了一种创新、实用且具有广阔临床转化前景的新方法，有望推动羊膜在更广泛的再生医学和组织工程领域中得到应用。
