《Neuropsychopharmacology》：Functional genomic profiling of schizophrenia-associated genes reveals key microglial regulators
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为探究精神分裂症（SCZ）相关基因在小胶质细胞（Microglia）中的功能影响，研究人员利用基于CRISPR的阵列筛选平台，在人多能干细胞诱导的类小胶质细胞（piMGLCs）中靶向30个SCZ相关基因，通过高内涵成像和转录组测序，鉴定了包括CYFIP1、MSR1、TREM2、SYK、ITGB2、ITGAM和IRF8在内的关键基因，其调控了突触小体的吞噬功能、细胞形态和激活状态，并揭示了与吞噬、活化、细胞骨架和溶酶体功能相关的不同通路，为理解小胶质细胞在SCZ病理生理学中的作用提供了新机制见解，并建立了可扩展的神经免疫遗传筛选平台。
精神分裂症（Schizophrenia, SCZ）是一种复杂且高度遗传性的神经精神疾病，患者常出现幻觉、妄想、认知缺陷和社交退缩等症状，通常在青春期晚期或成年早期发病。尽管全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出数百个与SCZ相关的基因位点，包括许多免疫相关基因，提示了突触和神经免疫通路之间存在重叠，但小胶质细胞（大脑常驻免疫细胞）在SCZ发病机制中的具体作用，特别是SCZ风险基因如何影响小胶质细胞功能，仍是一个未充分探索的领域。小胶质细胞是神经发育和功能的关键调节者，它们通过补体依赖等机制介导突触修剪（synaptic pruning），以维持大脑稳态。尸检、活体成像和转录组学研究均暗示，在SCZ患者中存在炎症基因表达增加、小胶质细胞形态和活动改变的现象。此外，源自患者的体外模型表明，来自SCZ个体的类小胶质细胞存在过度的突触吞噬。然而，在人类小胶质细胞中破坏SCZ相关基因的功能后果仍然未知。为了填补这一知识空白，并深入理解小胶质细胞在SCZ中的角色，一项发表在《Neuropsychopharmacology》上的研究应运而生。
为了系统探究SCZ相关基因在小胶质细胞中的功能，研究人员开展了一项整合功能基因组学、细胞表型和转录组学分析的研究。研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们利用来自外周血单核细胞（PBMC）经转分化获得的人诱导类小胶质细胞（piMGLCs）作为研究模型。其次，研究采用了基于CRISPR-Cas9的阵列式基因靶向筛选技术，通过核转染递送预组装的核糖核蛋白（RNP）复合体（包含Cas9蛋白和单导RNA）来实现对目标基因的高效编辑。第三，他们建立并优化了基于高内涵共聚焦成像的体外突触修剪模型，通过使用pHrodo染料标记的人iPSC来源的神经元突触小体（synaptosome），定量检测piMGLCs的吞噬指数。第四，研究利用多重RNA测序平台（DRUG-seq）对基因靶向后的细胞进行了高通量转录组分析，以揭示下游的分子通路和机制。
靶向功能遗传筛选鉴定调控突触小体吞噬的基因
为了筛选SCZ易感基因，研究团队聚焦于那些既在小胶质细胞中表达，又在SCZ患者尸检转录组研究中被发现差异表达的基因，并通过基因本体（GO）分析富集了与吞噬作用相关的通路，最终筛选出30个基因进行初筛。研究人员在piMGLCs中采用了阵列式RNP-CRISPR系统，每个靶基因使用三条sgRNA。转导六天后，使用pHrodo标记的人iPSC神经元来源的突触小体进行吞噬功能筛选，并通过免疫细胞化学标记IBA1识别小胶质细胞，利用高内涵共聚焦成像定量吞噬指数。初筛结果显示，与阴性对照相比，靶向七个基因（如ITGB2、ITGAM）增加了吞噬活性，而靶向大多数基因（如MSR1、CYFIP1）则降低了吞噬活性。为了独立验证初筛结果，研究人员对九个初筛中效果显著的基因进行了二次筛选，使用了重新设计的正交sgRNA。结果证实，靶向ITGB2和ITGAM增加了吞噬作用，而靶向MSR1和CYFIP1则减少了吞噬作用，且这些处理未影响细胞活力。两次筛选的结果在多数基因上表现出相关性。
表型筛选鉴定调控小胶质细胞形态和激活状态的基因
研究同时利用成像平台，在初筛和二次筛选中同步测量了细胞形态参数（如坚实度和偏心率）以及吞噬功能，以此作为小胶质细胞激活状态的指标。例如，靶向ITGB2和ITGAM导致细胞变得更偏向阿米巴样形态（高坚实度、低偏心率），而靶向VAV1和SYK则导致细胞更偏向分支状形态。形态学改变在两次筛选中具有可重复性。分析发现，形态与吞噬功能相关：偏心率增加与吞噬作用降低相关，而坚实度增加通常与更高的吞噬作用相关。此外，研究还纳入了激活标记物CD68的表达水平进行分析，发现CD68表达与吞噬活性呈正相关。通过主成分分析（PCA）对坚实度、偏心率、吞噬作用和CD68表达进行降维分析，结果显示不同基因靶向导致了不同的功能小胶质细胞状态聚类，例如ITGAM和ITGB2靶向组表现出高激活和高吞噬能力特征，而CYFIP1、TREM2和MSR1组则表现出较低的激活和吞噬功能。
转录组分析揭示基因靶向对小胶质细胞状态的多样化影响
研究人员进一步使用DRUG-seq（一种用于药物发现的高通量转录组分析技术）来研究在稳态下（无突触小体刺激）单个基因靶向对piMGLCs转录组的影响。在30个靶向基因中，有21个导致其自身转录本水平发生显著改变。对靶基因之间的表达进行交叉分析，生成了一个配对差异表达矩阵，揭示了它们之间潜在的调控关系，其中23%的关系与STRING数据库中记录的蛋白互作网络一致，而41%的关系是未报道过的，可能代表了小胶质细胞特异性的调控网络。转录组分析还识别出那些在CRISPR靶向后对转录组影响最深的基因，例如TREM2、IRF8、HLA-DMB和SYK，它们的扰动导致了广泛的转录重编程。值得注意的是，尽管ITGB2和ITGAM都编码补体受体3（CR3）的亚基，但靶向ITGB2产生的差异表达基因（DEG）数量约是靶向ITGAM的5倍，提示它们可能存在非重叠的功能。
基因靶向诱导的功能程序
通过GO生物过程富集分析，研究人员将受影响的通路归纳为几大功能类别，包括趋化因子/细胞因子信号、溶酶体通路、吞噬作用、细胞死亡、细胞粘附、肌动蛋白细胞骨架重塑、代谢、蛋白质生成、补体激活和自噬。靶向不同基因影响了不同的功能程序。例如，靶向TREM2和SYK影响了小胶质细胞功能的核心过程，包括吞噬作用、溶酶体组织和酸化、细胞激活、细胞因子/趋化因子信号和肌动蛋白细胞骨架重塑。靶向IRF8和TREM2影响了最广泛的GO过程，证实了它们在小胶质细胞调控中的核心作用。靶向TLR2影响了蛋白质生成和溶酶体酸化过程，而靶向NCKAP1L则特别富集于溶酶体酸化和肌动蛋白细胞骨架组织。研究人员进一步比较了基因靶向在四个显著富集过程中的基因水平变化：1）吞噬作用：在TREM2、SYK和IRF8靶向中显著富集，其中TREM2影响了该类别中最多数量的基因。2）溶酶体组织：在ITGB2、TLR2、NCKAP1L和TREM2靶向中受影响，突出了吞噬溶酶体过程的破坏。3）巨噬细胞激活：在TREM2、IRF8和SYK靶向中显著富集，靶向SYK和TREM2导致了高度一致的转录谱。4）细胞形状调控：在多个靶点中富集，反映了信号介导和细胞骨架重塑过程。
本研究通过整合CRISPR筛选、高内涵成像和转录组学分析，在人类类小胶质细胞模型中系统探究了SCZ相关基因的功能角色。研究结果鉴定出一个调控吞噬作用、形态和激活状态的小胶质细胞基因子集，包括CYFIP1、MSR1、TREM2、SYK、ITGB2、ITGAM和IRF8等关键基因。这些发现增进了我们对小胶质细胞参与SCZ机制的理解。研究表明，SCZ相关基因通过不同的分子机制调节小胶质细胞的关键功能。例如，一些基因（如ITGB2、IRF8、TREM2）通过直接影响受体或溶酶体功能来降低吞噬能力；另一些基因（如IRF8、TREM2、SYK）则通过改变细胞激活或生存通路，或通过转录因子（如IRF8）进行直接转录调控来发挥作用。表型效应与转录组广度并不总是一致，这凸显了不同基因通过不同的调控模式影响小胶质细胞功能。这项研究的意义在于，它将大规模遗传关联研究与细胞机制洞察联系起来，为理解SCZ的神经免疫基础提供了新的实验证据。更重要的是，它建立了一个可扩展的功能基因组学平台，可用于小胶质细胞的疾病建模和治疗发现，这不仅适用于SCZ，也对其他神经发育或神经退行性疾病的研究具有借鉴价值。研究鉴定的调控枢纽和冗余基因网络，为后续机制跟进和潜在的干预策略提供了关键靶点。
