《Nature Communications》：Engineering a compact high-fidelity Staphylococcus aureus Cas9 variant with broader targeting range and mechanistic insights into its activation
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研究人员为突破CRISPR-Cas9基因组编辑中靶向范围与靶向特异性难以兼得的瓶颈，对金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）进行了理性工程化改造。研究成功开发了新型核酸酶eSaCas9-NNG，它能够识别更宽松的NNG PAM，在人类细胞和小鼠体内高效诱导indels和碱基转换，同时保持了较高的靶向保真度，为体内基因治疗提供了更具前景的工具。
基因组编辑技术，特别是基于CRISPR-Cas9的系统，已彻底改变了生命科学研究并展现出巨大的治疗潜力。在众多CRISPR-Cas9核酸酶中，来自金黄色葡萄球菌的Cas9（Staphylococcus aureus Cas9, SaCas9）因其尺寸小于广泛使用的化脓链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9, SpCas9），能够被包装进单个腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体中进行递送，因而成为体内基因治疗的理想候选工具。然而，SaCas9存在一个关键限制：其识别目标DNA需要一段较长的NNGRRT（其中N代表任意核苷酸，R代表A或G）原型间隔序列相邻基序（protospacer adjacent motif, PAM）。这种严格的PAM要求极大地限制了其在基因组中的可靶向范围，使得许多潜在的治疗靶点无法被触及。
为了扩大靶向范围，科学家们已经成功开发了多种PAM要求更宽松的Cas9变体。但一个普遍存在的、近乎根本性的难题随之而来：PAM的放宽往往伴随着靶向特异性的下降，即脱靶效应的增加。这种“鱼与熊掌不可兼得”的困境，阻碍了高安全性、高适用性基因编辑工具的开发，尤其是在对精准度要求极高的临床治疗领域。那么，能否打破这一僵局，创造出一个既能识别更宽松PAM，又能保持高靶向保真度的新型Cas9变体呢？这正是本研究团队致力于解决的核心科学问题。
研究人员聚焦于更紧凑的SaCas9，通过理性蛋白质工程策略，成功构建了一个名为eSaCas9-NNG的新型变体。这一变体的革命性在于，它将PAM识别序列从原来的NNGRRT成功放宽至NNG，从而在理论上将基因组内的可编辑位点数量扩展了数倍。更重要的是，eSaCas9-NNG在实现广泛靶向的同时，并未以牺牲精确性为代价。研究团队在人类细胞和小鼠模型中验证了其高效性，eSaCas9-NNG能够在含有NNG PAM的内源性位点上高效地诱导插入/缺失（indels）和碱基转换，其编辑效率与SpRY、SpG、iGeoCas9等其他已报道的PAM宽松型核酸酶相当。然而，关键的突破在于，eSaCas9-NNG展现出了显著降低的脱靶活性，有效克服了靶向范围与靶向特异性之间的传统权衡。
为了深入理解eSaCas9-NNG为何能兼具这两种优良特性，研究团队转向了结构生物学。他们利用冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术，成功解析了eSaCas9-NNG在五种不同功能状态下的高分辨率三维结构。这些结构“快照”如同一部分子电影，清晰地揭示了eSaCas9-NNG如何与含有NNG PAM的DNA靶标结合，其PAM识别域发生了哪些关键构象变化以实现对更短、更宽松PAM的特异性识别。同时，结构分析也为解释其高靶向保真度提供了线索，阐明了与DNA正确配对检查及核酸酶催化活性激活相关的精细分子机制。这项工作不仅成功开发了一个极具应用价值的基因组编辑新工具，也加深了我们对CRISPR-Cas9家族核酸酶工作机理的普遍理解。
本研究发表在国际知名期刊《Nature Communications》上，为开发下一代安全、高效的体内基因治疗工具奠定了坚实基础。
研究主要采用了以下关键技术方法：通过理性设计与定点突变对SaCas9进行蛋白质工程改造；在人类细胞系（如HEK293T、U2OS等）和小鼠体内模型中评估核酸酶的编辑效率与特异性；利用高通量测序（如NGS）定量分析基因编辑结果（indels频率、碱基编辑效率）和全基因组范围内的脱靶效应；借助冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析技术，解析eSaCas9-NNG在结合sgRNA、目标DNA/非目标DNA链等不同状态下的高分辨率三维结构，以阐明其分子机制。
eSaCas9-NNG 的设计与体外特性表征
为了扩展SaCas9的靶向范围，研究人员基于结构信息对其PAM识别界面进行了系统性理性设计。他们通过引入一系列关键氨基酸残基的突变，构建了能够识别NNN PAM的初步变体。然而，广泛的突变筛选发现，完全放宽至NNN会导致脱靶效应急剧增加。通过迭代优化，他们最终获得了最佳变体eSaCas9-NNG。体外生化实验表明，eSaCas9-NNG能够高效切割含有NNG PAM的DNA底物，同时保持对含有NNGRRT PAM底物的切割活性。与野生型SaCas9相比，eSaCas9-NNG对含有单个错配的DNA靶标的耐受性更低，这初步预示了其可能具有更高的靶向特异性。
eSaCas9-NNG 在人类细胞中的高效编辑与高保真度
接下来，研究团队在多种人类细胞系中评估了eSaCas9-NNG的功能。他们在多个内源性基因位点（如VEGFA、EMX1、FANCF等）设计了靶向NNG PAM的引导RNA（sgRNA）。实验结果显示，eSaCas9-NNG能够在这些位点高效地诱导indels，其编辑效率与已报道的SpRY、SpG等先进PAM宽松型核酸酶相当。为了严格评估脱靶风险，研究人员采用了全基因组水平的检测方法，如GUIDE-seq和SITE-seq。分析结果表明，与识别NNGRRT PAM的野生型SaCas9-KKH变体相比，eSaCas9-NNG在全基因组范围内检测到的脱靶位点数量显著更少，其脱靶活性与高保真度的SpCas9变体（如SpCas9-HF1）处于同一水平，从而在实验上证实了其“高保真”特性。
eSaCas9-NNG 支持在体碱基编辑并在小鼠模型中验证
为了探索eSaCas9-NNG在基因治疗中的应用潜力，研究团队将其与胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）融合，构建了对应的碱基编辑器eSaCBE-NNG和eSaABE-NNG。在人类细胞中，这些编辑器能够在NNG PAM位点实现高效的C•G to T•A或A•T to G•C碱基转换。更重要的是，研究将eSaCBE-NNG通过AAV载体递送至小鼠肝脏，成功在体内实现了对Pcsk9基因目标位点的高效编辑，显著降低了小鼠血清中的PCSK9蛋白水平和胆固醇水平，这直接证明了eSaCas9-NNG在体基因治疗中的可行性与有效性。
eSaCas9-NNG 识别NNG PAM和激活机制的冷冻电镜结构解析
为了在原子层面理解eSaCas9-NNG如何实现宽松PAM识别与高保真度的统一，研究人员利用冷冻电镜解析了五个关键状态的结构：apo状态、与sgRNA结合状态、与含有NNG PAM的目标DNA前体复合物状态、与含有NNG PAM的目标DNA激活（催化前）状态、以及与含有单碱基错配DNA的复合物状态。结构分析表明，eSaCas9-NNG中一个名为K848的关键残基的突变，使其能够与NNG PAM中的第二个G碱基形成稳定的氢键相互作用，这是其识别NNG PAM的结构基础。同时，结构揭示了其催化核心HNH核酸酶结构域的激活机制：只有在目标DNA与非目标DNA链完全正确配对，并且PAM被正确识别后，HNH结构域才会发生大幅度的构象重排，从“自抑制”状态转变为“激活”状态，进而切割目标DNA链。这种严格的、多步骤的构象检查机制，是eSaCas9-NNG在PAM放宽后仍能保持高特异性的分子基础。与错配DNA复合的结构显示，单个错配就足以阻止HNH结构域的正确构象变化，从而抑制切割活性。
总结与讨论
本研究成功通过理性蛋白质工程，构建了一个兼具广泛靶向能力与高靶向特异性的新型CRISPR-Cas9核酸酶变体eSaCas9-NNG。它能够高效识别NNG PAM，在人类细胞和小鼠体内实现高效、精确的基因编辑（包括indels形成和碱基编辑），其编辑效率与主流PAM宽松型工具相当，但脱靶活性显著降低。通过多状态冷冻电镜结构解析，研究从机理上阐明了eSaCas9-NNG实现宽松PAM识别和维持高保真度的结构基础，特别是揭示了其HNH核酸酶结构域严格依赖于正确靶标识别的“变构激活”机制。
这项研究的核心意义在于，它打破了CRISPR-Cas9基因组编辑中长期存在的“靶向范围”与“靶向特异性”之间的根本性权衡（trade-off），证明通过合理的工程设计可以同时优化这两个关键性能指标。eSaCas9-NNG本身作为一个紧凑型核酸酶，与AAV递送载体高度兼容，使其成为进行体内基因治疗（尤其是需要靶向基因组中更多位点的复杂疾病）的一个极具前景的通用型平台工具。更重要的是，该研究提供的详尽结构机制见解，为未来进一步设计和优化其他CRISPR-Cas系统提供了宝贵的原理性指导和框架，推动着基因组编辑技术向更安全、更强大的方向发展。
