《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Development and validation of a quantitative pcr array assay for the detection of viral sequences in breast cancer
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本研究针对乳腺癌（BC）组织中多种致癌病毒同步检测的技术瓶颈，开发并验证了一种可同时靶向21种病毒序列的qPCR Multiplex Array方法。结果显示该方法特异性强、线性好（R2> 0.98）、重复性高（CV < 5%），并在临床样本中成功检出HPV（30%）、MMTV（24%）及EBV（0.6%）等病毒，为病毒参与乳腺癌发病机制的分子流行病学研究提供了高效可靠的技术平台。
长期以来，科学家们一直在探索病毒等传染性病原体在癌症发生发展中的作用。世界卫生组织（WHO）数据显示，2020年全球新发乳腺癌（Breast Cancer, BC）约230万例，死亡约68.5万例。国际癌症研究机构（IARC）预测，到2030年新发病例将增长21%，达到约274万例。值得注意的是，相当一部分人类癌症具有传染性病因，例如高危型人乳头瘤病毒（HPV）、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）等病毒通过表达致癌基因或诱导慢性炎症，驱动了全球超过90%的感染相关癌症。然而，在乳腺癌领域，尽管有研究提示HPV、小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV）、EB病毒（EBV）等可能与乳腺癌发生有关，但此前的研究多为针对单一病毒的孤立检测，缺乏能够同时筛查多种病毒的高通量、标准化技术平台。特别是在墨西哥等中低收入国家，乳腺癌死亡率持续居高不下，部分原因在于诊断技术受限。因此，开发一种能够一次性检测多种乳腺癌相关病毒的高效分子工具，对于阐明病毒在乳腺癌中的潜在作用、改善分子诊断水平具有重要意义。
在此背景下，Karina del Carmen Trujillo-Murillo等研究人员在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》上发表研究，旨在开发并验证一种定量PCR Multiplex Array（qPCR Array）方法，用于同时检测乳腺癌组织中的21种病毒序列，并评估其作为分子研究和诊断工具的潜力。
主要技术方法概述
研究团队收集了172例经病理确诊的乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本及10例非肿瘤乳腺组织样本（来自墨西哥高专科区域医院HRAECS）。技术路线的核心是建立多重实时荧光定量PCR（qPCR）检测体系：首先提取样本总核酸并进行质量评估；随后针对HPV、MMTV、EBV等21个病毒靶点设计特异性引物和TaqMan探针，并利用gBlocks Gene Fragments作为阳性对照进行标准曲线建立；最后通过特异性、灵敏度（R2> 0.98，效率90–110%）和重复性（CV < 5%）验证，优化建立可同时检测多靶点的qPCR Array。
研究结果
1. 引物探针设计与阵列构建
研究人员基于GenBank中与人类癌症相关的病毒保守序列，设计了特异性引物和TaqMan探针（标记FAM、VIC、NED荧光），构建了一个包含21个病毒靶点的qPCR Array。靶点涵盖了10种高风险HPV型别（16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 68）、MMTV、EBV、CMV、HSV-1、HSV-2、HHV-8、BLV、HTLV-1和HTLV-2。该阵列还整合了人β-球蛋白（HBB）基因作为DNA质量内参，以及大肠杆菌Aat基因作为反应内参，以确保检测结果的可靠性。
2. 分析性能验证
使用浓度为10 ng/μL的gBlocks基因片段作为阳性对照，进行8个10倍系列稀释建立标准曲线。分析显示，所有qPCR检测均表现出优异的线性关系，决定系数（R2）均大于0.98，扩增效率在90%至110%之间，符合MIQE指南要求。在特异性方面，交叉反应测试证实各引物探针组仅对其目标病毒gBlock产生信号，无交叉反应。在重复性方面，批内和批间检测的循环阈值（Ct）变异系数（CV）均小于5%，证明了该方法的高精密度和稳定性。
3. 临床样本检测与验证
将建立的方法应用于172例乳腺癌FFPE样本，结果显示病毒序列检出率为：HPV 30%（51/172）、MMTV 24%（41/172）、EBV 0.6%（1/172）。对阳性样本进行Sanger测序验证，结果显示与GenBank参考序列的一致性为100%。在10例非肿瘤乳腺组织对照样本中未检测到相关病毒序列，进一步支持了该方法在临床样本检测中的特异性。
研究结论与意义
本研究成功建立并验证了一种高特异性、高灵敏度的qPCR Multiplex Array方法，能够实现单管反应中21种乳腺癌相关病毒序列的同步检测。该技术解决了传统单一检测通量低、样本消耗大、成本高的问题，为大规模临床样本的病毒筛查提供了高效工具。在墨西哥南部乳腺癌人群中的初步应用证实了HPV、MMTV等病毒在肿瘤组织中的存在，虽然这仅表明病毒与肿瘤存在关联，尚不能直接证明因果关系，但为后续深入研究病毒在乳腺癌发病机制中的作用奠定了方法学基础。未来结合转录组学、功能实验及临床病理特征分析，将有助于阐明这些病毒是否在特定亚型的乳腺癌中扮演致癌驱动角色，并可能为开发新的预防或治疗策略提供线索。
