《Bioactive Materials》：Emerging engineering strategies in bone organoids: From biomimetic scaffolds to dynamic microenvironmental stimulation
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这篇综述系统阐述了构建功能性骨类器官的先进工程策略。作者指出，骨作为一种高度矿化、承受动态机械负荷的硬组织，其体外模型构建面临独特挑战。文章重点探讨了从静态仿生支架向动态形态发生模板的范式转变，深入分析了模拟骨发育（如膜内成骨和软骨内成骨）的工程策略、优化质量传输的拓扑设计（如TPMS结构），以及集成智能响应材料（压电、磁响应等）和器官芯片技术来构建动态微环境的创新方法。最后，展望了3D生物打印、微流控与人工智能等多学科融合推动骨类器官从基础研究迈向临床个性化医疗的潜力。
骨类器官作为研究骨骼发育和疾病的新型体外模型，通过高度模拟体内复杂的细胞生态系统，为再生医学领域带来了变革。然而，与软组织不同，骨骼独特的矿化基质和高度动态的机械环境对经典的自组装策略构成了巨大挑战。因此，工程策略不仅是辅助性的，更是构建功能性骨类器官的核心。本文旨在全面概述旨在克服这些生物学障碍的先进工程策略。
骨类器官的生物学原理与工程必要性
天然的骨组织拥有复杂的三维结构、动态的血管网络以及细胞外基质（ECM）的持续重塑能力。骨骼发育和再生严格受物理微环境驱动，主要通过两种不同的机制：膜内成骨和软骨内成骨。膜内成骨是指骨髓间充质干细胞（MSCs）直接分化为成骨细胞并在胶原基质上沉积矿物质，主要发生在颅骨等非承重的扁平骨中。而长骨等承重骨的发育则主要依赖于软骨内成骨，即先形成软骨模板，随后经历血管侵入、软骨基质降解并逐渐被骨组织替代。
理解骨发育的内在逻辑、致密基质中物质传输的限制以及多细胞群之间的通讯网络，是设计工程策略的理论基石。例如，要重现膜内成骨过程，形态发生模板需要满足两个要求：引导MSCs高密度聚集，并通过高刚度直接促进MSCs的成骨分化。研究表明，基质的硬度是关键物理线索：坚硬的基质（模拟骨ECM，25-40 kPa）可显著促进MSCs向成骨表型分化，而较软的基质（模拟脑或软骨组织，0.1-1 kPa）则诱导神经元样或软骨表型。这种由硬度诱导的分化效应与细胞固有的肌动球蛋白张力系统密切相关。
相比之下，重现软骨内成骨过程则更为复杂。为了忠实地复现其发育轨迹，工程化的机械生态位必须动态演化，以驱动从软骨模板到矿化骨类器官的阶段转变。早期发育阶段以压缩刺激为特征，而随着类器官成熟并模拟软骨内骨化的血管侵入阶段，机械生态位必须纳入拉伸和流体动力。间歇性拉伸提供了推进成熟所需的节律性线索，而间隙流体流动在类器官发育后期则充当基质矿化的主要机械开关。除了直接的机械负荷，低强度脉冲超声作为一种声能，也因其非侵入性在骨组织工程中备受关注。
此外，天然骨组织是一个高度有序的细胞社会，其稳态依赖于成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和免疫细胞之间复杂的相互作用。这种细胞间通讯并非随机发生，而是依赖于严格的空间分隔和信号梯度。在缺乏工程引导的共培养模型中，不同类型的细胞往往无序生长，无法建立像骨单元那样的有序结构，导致信号通路紊乱。因此，骨类器官的构建必须依赖工程方法，以提供空间模板，将自组装限制在特定的结构框架内，从而引导混乱的细胞群成为具有有序结构和复杂通讯功能的仿生组织。
形态发生模板的设计策略
在骨类器官的构建中，三维支架已演变为不仅仅是细胞粘附的被动载体，而是充当形态发生的物理模板。本章结合骨类器官的独特特征和发育过程，系统阐述了工程化骨类器官模板的设计准则，聚焦于三个关键维度：力学仿生、传质优化和拓扑引导。
多孔结构
与软组织类器官不同，骨类器官的构建面临着更严峻的物质传输挑战，这不仅是由于组织尺寸增大，还源于骨组织独特的矿化基质。经典理论表明，当无血管细胞团的直径超过200-400 μm时，其核心区域会显著缺乏氧气和营养物质，导致“核心坏死”现象。随着骨类器官成熟和矿化，羟基磷灰石晶体在基质中紧密堆积，导致孔隙率和有效扩散系数急剧下降。天然骨通过哈佛系统——一个精细的微管网络——解决了这一物理矛盾。然而，细胞无法在体外自发组装出这种长距离且贯通的通道。因此，引入工程化的形态发生模板变得必要。通过设计具有高连通性（孔隙率50%-80%）的多孔支架（孔径>100 μm），可以在微观尺度建立人工物质传输通道，以克服菲克定律在致密矿化组织中的失效，从而维持大规模骨类器官的存活和功能。
仿生层级结构
天然骨是一种具有多级分层结构的复合材料。从纳米级的矿物沉积到微米级的骨小管网络，再到宏观的皮质骨和松质骨划分，这种跨尺度的有序性共同赋予了骨骼优异的力学性能和生物学功能。因此，在骨类器官构建中引入层级梯度设计，通过精心设计的多级孔径、孔隙率和孔隙几何形状组合，不仅可以协同优化形态发生模板的力学性能、渗透性和生物活性，还能精确模拟体内环境的结构异质性。这种仿生设计可以通过调节细胞与ECM的相互作用并激活不同的细胞内信号通路，直接影响体外模型中细胞的粘附、迁移、增殖和成骨分化行为，从而作为多细胞自组织的几何编排者，为骨类器官建立高度逼真的微环境。
传质性能的优化设计
物质传输效率决定了骨类器官能否突破尺寸限制并避免核心坏死。优化传质需要一个多尺度的方法，涵盖细胞球体内部的微观扩散和通过模板的宏观灌注。在微观尺度，致密细胞团内部的营养扩散严格受到菲克定律的限制。研究表明，类球体内的氧梯度高度依赖于尺寸。虽然过大的聚集尺寸不可避免地导致严重的缺氧和病理性的核心坏死，但精确控制的空间限制可以在类球体核心诱导适度的生理性缺氧。这种局部、可控的缺氧生态位作为一个强有力的触发因素，激活HIF-1α通路和强有力的VEGF分泌，从而协调类器官内在的血管生成潜能。
在宏观尺度，工程模板必须同时优化物质传输以维持这些自组装的类球体。它通过引入高度互连的多孔网络，将纯粹的被动扩散转化为“扩散-对流”耦合传输。为了量化模板的这种宏观物质传输效率，引入了流体力学中的渗透率概念。根据Kozeny-Carman方程，渗透率与孔隙率成正比。研究表明，为了获得与天然松质骨相似的渗透率，模板的孔隙率通常需要保持在60%到90%之间。然而，过高的孔隙率会显著降低模板的机械强度。通过设计多孔模板的拓扑形态，可以在不牺牲机械强度的前提下，通过降低经验常数来改善渗透率。虽然高渗透率有利于营养物质的宏观传输，但支架内部的水动力环境，特别是在动态培养环境中，壁面剪切应力对细胞命运具有决定性影响。因此，在设计支架的传质性能时，不能单纯追求最大渗透率，而必须结合计算流体动力学模拟，在高效物质传输和适当机械刺激之间找到最佳的拓扑平衡。
三周期极小曲面结构
支架的微观拓扑结构是调控细胞形态、排列和分化命运的重要物理线索。在众多的拓扑构型中，三周期极小曲面（TPMS）结构因其与天然骨小梁拓扑形态的高度相似性而备受关注。由于TPMS结构由光滑连续的曲面构成，在应力传递方面显著优于传统的实体多孔结构，可以实现有效的结构轻量化以及与天然骨匹配的力学行为，并促进干细胞向成骨分化。TPMS结构具有独特的表面曲率特征，可以有效影响细胞的成骨行为。其数学连续性赋予支架极其光滑的表面特征，消除了传统桁架结构中的应力集中点，有利于细胞粘附和铺展。这种连续性和光滑性使得TPMS结构在相同孔隙率条件下，其经验常数显著低于传统桁架结构，从而在不损害支架力学性能的前提下有效增强渗透率。这一特性不仅有利于营养物质的快速传输，还能更有效地将流体剪切应力传递到支架深处的细胞表面，激活机械转导信号。
因此，TPMS结构已成为高效的形态发生模板。研究表明，与传统结构相比，TPMS结构通过表面曲率诱导细胞的定向弯曲，促进Lamin A/C的表达。这种机械限制激活了细胞内FAK/MAPK通路，积极地驱动成骨发育轨迹，而不仅仅是支持细胞存活。在微观尺度上，研究表明TPMS通过双路径形态发生机制决定类器官的命运。一方面，TPMS固有的零平均曲率显著增强了内部流体渗透性和代谢交换，缓解了致密类器官内的扩散限制。另一方面，TPMS上广泛分布的负高斯曲率作为物理接触引导线索，迫使接种的细胞沿着表面的主方向排列和延伸。这种由微观几何形态诱导的细胞骨架张力重组可以直接转化为生化信号，显著上调RUNX2等关键成骨基因的表达。
除了优异的传质性能，TPMS结构的另一个核心优势在于其能够精确复制天然骨复杂的力学各向异性。传统的桁架或格子支撑结构通常表现出均匀的拉伸和压缩特性，这与天然骨在不同加载条件下的非线性响应有根本不同。最新的研究表明，基于Diamond拓扑设计的3D打印钛合金支架可以再现皮质骨独特的拉压不对称性，其拉伸模量显著高于压缩模量。这种源自TPMS孔拓扑结构的内在力学不对称性，直接作为一种物理诱导模板，为引导前成骨细胞自组织提供了高度仿生的机械微环境。因此，TPMS结构不仅是细胞的物理载体，更是一个集高效传质和主动诱导功能于一体的智能微环境，是构建功能化骨类器官的理想拓扑选择。
动态微环境的构建策略与生物学效应
骨骼不仅是一个物理支撑结构，更是一个处于高度动态机械环境中的生理系统。其发育、稳态维持和重塑过程始终受到流体剪切、机械负荷和生物电信号的精确调控。虽然传统的静态3D培养提供了基本的空间边界，但难以重现这种复杂的动态生理微环境。因此，体外培养的骨类器官往往因缺乏必要的物理指令而难以形成成熟的矿化结构和功能。构建功能性骨类器官的关键在于引入能够模拟体内机械环境的动态刺激系统。
材料介导的智能响应
尽管外部物理场刺激有效，但复杂的3D类器官培养常常面临深层信号衰减或设备连接繁琐的问题。为解决这一局限，智能响应材料被引入下一代骨类器官模板。这些材料从被动的结构填料转变为主动的传感器，感知外部无线场（磁、声或光），并在局部将其转化为原位电、机械或热指令，从而从内到外协调多细胞自组织。
电响应材料
电响应材料的核心在于其压电效应或导电性。骨的压电特性使其能够将机械应力转化为内源性电信号，从而驱动胚胎骨骼发育和终生重塑。压电材料在受到机械应变时会产生电极化，在材料表面形成电势。导电材料，如聚吡咯，可以为细胞提供电子转移的通道，或在施加电场下发生物理变形。对于骨类器官而言，这些局部电信号的优势在于能够直接激活细胞膜上的电压门控钙离子通道，促进早期间充质凝聚，并引导发育轨迹，而无需笨重的外部电极。
基于此原理，研究人员开发了多种模拟天然骨组织电学特性的压电和导电生物材料。在压电陶瓷领域，钛酸钡和氧化锌等无铅材料因其良好的生物相容性备受关注。研究表明，BTO涂层支架通过压电效应同时促进MSCs的成骨分化和血管生成过程。在压电聚合物领域，聚偏氟乙烯及其共聚物提供了必要的柔韧性。复合模板，如PVDF/TiO2和PVDF-TrFE/BNNTs，已被证明可加速成骨细胞成熟和ECM沉积。此外，研究发现像聚吡咯这样的导电聚合物可以在电场下发生可逆的形态转变，将瞬时的电-机械线索转化为持续的成骨信号。
电响应材料的显著优势在于其信号与骨组织的自然生理活动高度一致，可以直接干扰细胞的电生理过程。此外，压电材料可以实现机械能到电能的自驱动转换，无需外部持续供能。然而，该领域的发展仍面临严峻挑战。目前，大多数高性能压电陶瓷和聚合物在生理环境中难以生物降解，其长期存留带来的生物安全性风险不容忽视。同时，材料的压电效应长期稳定性在复杂的体内生物环境中能否持续，以及如何在3D骨类器官内部实现电信号参数的均匀精确调控，仍是必须解决的问题。
磁响应材料
磁响应生物材料通常由嵌入生物相容性基质中的磁性纳米颗粒组成。其独特的深层组织穿透能力为骨类器官的生物制造提供了显著优势。与宏观生物反应器中常在外围减弱的流体剪切应力不同，外部磁场可以均匀穿透致密的矿化基质，提供无线机械传导。
在所有类型的激励磁场中，静磁场研究最为广泛。在静磁场下，MNPs可以产生磁扭矩，对细胞膜或细胞内的磁受体施加机械刺激，从而影响离子通道。
