《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer》：Emerging advantages of nano delivery systems in enhancing CAR-T/CRISPR-Cas9 mediated cancer therapeutics
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病毒载体在CAR-T疗法和癌症疫苗中广泛应用，但存在免疫原性、插入突变和成本高等问题。非病毒纳米载体（如脂质纳米颗粒、聚合物等）作为更安全、可扩展的替代方案，通过靶向递送、智能响应和协同治疗提升疗效。CRISPR/Cas9技术优化基因编辑效率，纳米技术可增强T细胞和树突状细胞激活，但临床转化仍面临生物分布不均、规模化生产等挑战。
Vikas Kumar Sahu|Purbasha Das|Subhasree Roy Choudhury|Surajit Karmakar
印度旁遮普邦Mohali 140306，知识城第81区，纳米科学与技术研究所
摘要
病毒载体在癌症免疫治疗中一直处于核心地位，尤其是在体外嵌合抗原受体（CAR）-T细胞工程和癌症疫苗开发方面。尽管取得了成功，但其临床应用仍受到免疫原性、插入突变、有限的载荷能力和高生产成本的限制。这些缺点不仅影响安全性，还阻碍了治疗的可扩展性和重复给药，而这两者对于长期控制癌症至关重要。为克服这些障碍，非病毒纳米载体系统作为一种多功能且更安全的替代方案应运而生。脂质纳米颗粒、聚合物平台、仿生外泌体样囊泡和基于水凝胶的系统能够实现核酸、免疫调节剂和化疗药物的靶向和可控递送，同时提高稳定性、降低全身毒性并改善生物相容性。除了被动递送外，这些智能纳米载体还可以通过配备肿瘤靶向配体、免疫检查点调节剂或刺激响应性释放机制来重新编程肿瘤微环境，从而增强T细胞和树突状细胞的活性。此外，纳米技术的模块化特性使得多种治疗剂（包括抗原、佐剂和检查点抑制剂）的联合递送成为可能，从而实现协同免疫治疗效果。最近在脂质纳米颗粒基mRNA疫苗的大规模生产和临床转化方面的进展进一步证明了这些系统在肿瘤学应用中的可行性。随着癌症免疫治疗向个性化及联合治疗方案发展，纳米生物技术为替代传统病毒载体提供了变革性的平台，推动了更安全、更有效且临床可扩展的治疗方法的进步。
引言
癌症每年导致近1000万人死亡，是仅次于心血管和脑血管疾病的第二大死亡原因[1]。在过去几个世纪中，已经开发出多种合理的癌症治疗方法。然而，我们不断发现这些方法的局限性[2]。手术、放疗、化疗和激素疗法是目前广泛使用的治疗方法。随着PROTACs、分子胶降解剂和基于最小残留病（MRD）的治疗策略的出现，针对KRAS、ERK和MYC等致癌驱动因素的靶向治疗正在快速发展[3]。溶瘤病毒治疗和定制癌症疫苗（包括基于mRNA的平台）领域也在不断扩大。癌症免疫治疗为肿瘤治疗领域带来了新的维度。该疗法的主要原理是通过调节免疫系统来摧毁肿瘤细胞。虽然传统的基因治疗和免疫治疗策略通常依赖递送载体来提高效率并确保靶向递送，但这些载体的特性和适用性存在显著差异[4]。尽管病毒载体因其高转染效率而被广泛使用，但它们也存在显著的局限性，如毒性、免疫原性和难以实现足够数量的纯化产物。非病毒载体更易于大规模生产，毒性较低且不具有免疫原性。这些特点，加上基因治疗对受体介导途径的主动靶向需求，使得非病毒载体成为开发癌症治疗的理想选择[5]。癌症免疫治疗的主要方法包括过继细胞疗法（ACT）、免疫检查点抑制和治疗性疫苗以及双特异性T细胞结合物（BiTEs）。所有这些策略都是通过刺激内源性或工程化的T细胞对肿瘤抗原的反应来发挥作用[6]。
CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了显著成功，这引发了人们对ACT的浓厚兴趣[7]。与传统化疗不同，ACT利用患者的免疫细胞来对抗疾病。这一过程包括从患者体内分离免疫细胞，在体外扩增和基因改造后重新输回体内，以特异性地靶向和清除癌细胞或感染细胞。主要的CAR-T细胞疗法有CAR-T细胞疗法、工程化T细胞受体（TCR）-T细胞疗法和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗[8]。基于CAR技术的新型ACT还包括CAR-natural killer（NK）、CAR-macrophage（M）、CAR-γδT和CAR-natural killer T（NKT）疗法。然而，CAR-T细胞疗法的准备所需时间较长是一个主要限制。此外，从接受血液系统治疗的患者体内获取足够数量的功能性T细胞也是一个挑战，因为他们的免疫系统往往受损。因此，基于纳米颗粒的递送平台可以通过在体内重新编程内源性T细胞来克服这一限制，而无需引发细胞因子风暴，从而增强其扩增、持久性和功能活性，无需进行大量的体外操作。此外，纳米载体还可以携带能够直接递送基因载荷或免疫调节剂的成分到循环或肿瘤浸润淋巴细胞，从而避免大规模采集患者T细胞的需求。另一个重要方面是使用基因编辑工具（如锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶和CRISPR/Cas9系统），这些工具有望克服CAR-T细胞疗法的相关挑战。由于CRISPR/Cas9操作更简单、效率更高，并利用RNA-DNA相互作用定位DNA位点，其性能优于其他两种基因编辑工具[9]。在这篇综述中，我们将探讨CAR-T、CRISPR/Cas9和其他细胞疗法在癌症免疫治疗中的最新进展，重点关注基于纳米技术的递送平台，这些平台能够靶向特定癌细胞并提高转染效率。同时，我们还将探讨病毒载体的当前应用及其固有的局限性和相关挑战。
CAR-T细胞疗法
CAR是一种新开发的针对多种癌症的免疫疗法。通过基因工程改造T淋巴细胞，使其能够识别、共刺激和激活抗原。CAR的主要组成部分包括：细胞外抗原结合域、铰链区、跨膜域和细胞内信号传导域。
这些疗法中的传统病毒载体
病毒载体由感染人类的亲本病毒衍生而来；致病基因被替换或删除，从而形成非致病性病毒。这些载体虽然种类多样，但具有几个关键的结构成分：病毒的遗传物质（RNA或DNA）、蛋白质包被的衣壳和包膜。病毒基因组编码必需的蛋白质，包括用于进入宿主细胞的包膜（Env）蛋白和参与逆转录（RT）的聚合酶（Pol）蛋白。
嵌合抗原受体架构和载体优化的进展
理想的CAR能够特异性结合肿瘤抗原，形成免疫突触，从而引发下游信号传导，最终产生强烈的抗肿瘤效应。第一代CAR的T细胞激活信号主要依赖于CD3-ζ，而第二代和第三代CAR则具有额外的共刺激结构。设计不佳的CAR会导致T细胞激活水平较低、肿瘤外活性不足以及抗原非依赖性的信号传导。
病毒递送系统的挑战
病毒载体非常有效且用途广泛，但在体内递送CRISPR/Cas9成分方面存在困难。尤其是腺相关病毒（AAVs）的载荷能力有限，只能携带约4.7 kb的遗传信息，这几乎不足以满足常用的Streptococcus pyogenes Cas9的需求[57]。使用较小的Cas9变体或将组件分散到多个载体中是常见的解决方法。
CRISPR基因编辑工具
CRISPR/Cas9系统是目前最先进的基因编辑技术之一，源自原核生物中的一种天然适应性免疫机制，用于抵御病毒感染。该系统已成功应用于人类免疫细胞（如T细胞和自然杀伤细胞），显示出其在免疫治疗及其他领域的潜在疗效[59]。CRISPR/Cas9机制的核心是两个功能域。
纳米递送系统的临床转化挑战
非病毒递送系统作为比病毒载体更安全的替代方案受到了广泛关注，但仍存在一些限制，影响其更广泛的临床应用。脂质纳米颗粒（LNPs）复杂的药代动力学和生物分布特性导致其在肝脏等器官中非特异性积累，对肝外组织的靶向能力有限，以及潜在的剂量依赖性全身毒性，这些都可能限制其效果。
纳米CAR-T的临床和临床前研究
基于纳米体的CAR构建体在胶质母细胞瘤异种移植模型中显示出强大的抗肿瘤活性，但一些研究也报告了靶标外毒性的风险。类似的研究在胶质母细胞瘤、黑色素瘤和乳腺癌模型中发现了成功的HER2特异性Nano-CAR候选物[141]。CD70靶向的nb70CAR-T细胞与表观遗传调节剂（如chidamide和decitabine）联合使用，显著提高了CD70表达并增强了CAR-T的效果。
结论
尽管CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了显著临床成功，但其广泛应用仍受到传统体外制造流程的复杂性、成本和安全性的限制。当前的临床策略需要依次进行自体T细胞的分离、基因改造、扩增和重新输注，这些步骤带来了重大的物流障碍，限制了其全球范围内的应用。尽管病毒载体
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢印度政府的生物技术部（DBT）（BT/PR40647/MED/31/436/2020）提供的资金支持。
