《Bioresource Technology》：Enhancement of the thermotolerance of Aspergillus niger for sodium gluconate production by combined metabolic engineering and fermentation process optimization
编辑推荐：
通过CRISPR-Cas9构建pyrG*营养缺陷型底盘，过表达甾醇C-5去饱和酶（erg3）和AMP脱氨酶（amd），发现amd过表达菌株COE-AMD在45°C下产量较野生型提高1.6倍，组学分析揭示其通过增强氨吸收实现代谢重编程和生长加速，补充铵盐进一步将生物量、酶活性和产物速率提升3.0、4.0和1.6倍，最终实现66小时内311.5±2.0 g/L的高效左旋葡萄糖酸钠生产。
孙静春|江媛媛|陈珍|蒋星|徐峰|王永明|田希伟|朱菊
华东科技大学生物反应器工程国家重点实验室，中国上海梅龙路130号，邮编200237
摘要
黑曲霉（A. niger）是葡萄糖酸钠（SG）生产的主要工业平台。然而，由于快速催化反应和中和作用产生的热应激会降低生产速率，甚至影响细胞存活率。为了开发出耐热细胞工厂，研究人员利用无DNA的CRISPR–Cas9编辑技术构建了一个pyrG*辅助营养型底盘，从而避免了在37°C下基因编辑导致的葡萄糖转化为SG时0.04 mol mol?1的产量损失。随后，将酵母来源的耐热相关基因——固醇C-5去饱和酶（erg3）和AMP脱氨酶（amd）在pyrG位点进行特异性过表达，结果发现过表达amd的菌株（COE-AMD）比过表达erg3的菌株具有更强的耐热性。值得注意的是，COE-AMD在45°C下的SG生产速率比野生型（WT）高出1.6倍，SG产量达到0.76 ± 0.03 mol mol?1。通过综合多组学分析发现，amd的过表达引发了系统的代谢重编程，特别是在对数生长后期增强了细胞内NH4+的吸收，这促进了COE-AMD在高温下的快速生长。基于这些组学发现，在初始培养基中添加0.4 g L?1的铵盐后，生物量、酶活性和产物生成速率分别提高了3.0倍、4.0倍和1.6倍。综上所述，耐热菌株COE-AMD在45°C下66小时内生产了311.5 ± 2.0 g L?1的SG，产量达到0.78 ± 0.03 mol mol?1。这项工作建立了一个完整的SG生产过程优化流程，基于组学的生物过程优化为理解黑曲霉的耐热机制提供了基础性见解。
引言
黑曲霉（A. niger）是一种广泛应用于葡萄糖酸生产的工业菌株（Raj等人，2024年）。市场预测显示，到2027年全球葡萄糖酸市场规模将达到10亿美元（Cairns等人，2021年）。黑曲霉的葡萄糖酸生产依赖于由葡萄糖氧化酶（GOD）和过氧化氢酶（CAT）组成的双酶系统。在发酵过程中，使用NaOH作为中和剂将pH值维持在5.5左右，从而将葡萄糖酸转化为葡萄糖酸钠（SG）（Ma等人，2022年）。然而，快速催化反应和中和作用引起的热应激会显著影响黑曲霉的代谢活性，进而威胁细胞的存活率（Zhang等人，2023年）。在大型生物反应器中，由于底物消耗和氧气吸收迅速，会产生大量代谢热。由于热传递和冷却效率的限制，尤其是在高粘度或高密度发酵系统中，可能会出现温度梯度 và 局部过热现象。这些条件会对微生物细胞造成热应激，导致酶活性下降、代谢效率降低和产量减少。因此，提高耐热性对于提升工业发酵过程的稳定性和生产力至关重要。此外，高温发酵还可以减少灭菌和冷却的成本，降低微生物污染风险，并防止发酵温度意外升高（Matsushita等人，2016年）。因此，开发耐热黑曲霉菌株对于工业规模的SG生产非常有必要。
目前提高丝状真菌耐热性的策略包括诱变筛选、适应性实验室进化（ALE）和代谢工程（Gao等人，2016年）。诱变筛选耗时费力，且ALE往往产生不稳定且不可预测的基因型。丝状真菌的代谢工程过去较为复杂（Cairns等人，2019年），但高效Cas9基因编辑技术的出现促进了靶向基因操作（de Crecy等人，2009年；Meyer等人，2016年）。迄今为止，提高丝状真菌耐热性的基因靶点主要集中在直接应对热应激的机制上，如热休克蛋白和转录因子HsfA，而在涉及多层次协调机制的靶点方面还存在研究空白（Li等人，2023年）。
近期组学技术的进步进一步加速了新型工程靶点的发现（Tian等人，2024年），膜工程也被证实可以提高酵母的耐热性。Caspeta等人发现固醇erg3（C-5去饱和酶）通过改变脂肪酸的饱和度来调节膜流动性，从而增强了酿酒酵母的耐热性（Caspeta等人，2014年）。类似地，Sandoval等人强调了脂质和细胞壁生物合成在热应激下维持膜稳态的作用（Sandoval & Papoutsakis，2016年），这种膜工程也提高了裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的耐热性（Kamthan等人，2017年）。这种膜对应激的普遍响应机制表明，基于组学的基因靶点发现策略具有跨物种适用性，可以加速工业菌株的基因靶点探索。除了固醇相关基因外，系统生物学分析还表明培养基诱导的膜应激可能干扰能量代谢。有研究显示，过表达amd基因（AMP脱氨酶）可以提高光滑念珠菌的耐酸能力（Wu等人，2018年），这表明能量工程可能增强真菌的耐逆性。目前，针对黑曲霉中固醇和ATP的相关靶点研究仍较为有限（Gao等人，2016年；de Mendoza & Pilon，2019年）。
在本研究中，对一种工业生产的黑曲霉菌株进行了耐热性改造。通过过表达酵母同源的erg3和amd基因分别增强了膜稳定性和调节细胞内ATP代谢。具体采用了以下三阶段策略：（1）使用无DNA的CRISPR–Cas9系统构建清洁的pyrG*辅助营养型底盘以避免随机整合；（2）筛选具有耐热性的工程菌株；（3）通过整合转录组学和13C标记的代谢组学分析阐明分子机制。最后，通过组学指导的过程优化提高了高温下的生产性能。
微生物、培养基和过程数据测量
本研究使用了来自中国工业菌种保藏中心的黑曲霉菌株CICC40350作为亲本菌株。
大肠杆菌 DH5α用于质粒的扩增。黑曲霉的摇瓶发酵和5-L生物反应器发酵方法参考了先前报道的协议，以便比较不同菌株之间的耐热性差异（Sun等人，2025年）。
摇瓶发酵特性：从茄子形培养瓶中洗出的孢子被分散后……
通过Cas9–核糖核蛋白策略构建靶向位点整合的底盘
为了提高黑曲霉的耐热性，最初选择了erg3和amd作为潜在的代谢靶点。序列比对发现黑曲霉基因组中存在两个ERG3同源基因（ERG3-1和ERG3-4）和一个AMD基因，其中ERG3-4被确认为酵母ERG3的功能结构同源物。因此，对这些基因进行了过表达改造。
为了避免不稳定性和不可预测性……
建立以pyrG*为目标的黑曲霉SG生产平台
黑曲霉的SG生产是一个体外催化过程，对生物量有严格要求。虽然生长过程中充足的氮供应对于合成关键酶（如GOD和CAT）至关重要，但过量的生物量积累会降低培养基粘度，阻碍O2的传质，而O2是氧化反应的关键底物。此外，多余的生物量会分流碳流，从而降低……
结论
本研究利用Cas9–RNP介导的pyrG辅助营养型底盘建立了精确高效的基因编辑平台。通过对潜在耐热性靶点的比较分析发现，通过过表达AMP脱氨酶（amd）调节细胞内ATP代谢比通过膜工程（erg3）更有效。所得菌株COE-AMD在45°C下的生长表现优异，SG产量比野生型提高了1.5倍。
未引用的参考文献
Mach等人，1994年；N?dvig等人，2015年。
CRediT作者贡献声明
孙静春：撰写初稿、数据可视化、数据整理。江媛媛：数据可视化、数据整理。陈珍：数据整理。蒋星：数据整理。徐峰：数据整理。王永明：撰写、审稿与编辑。田希伟：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。朱菊：撰写、审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFA0917700）、国家自然科学基金（编号32501316）、山东省泰山学者计划（编号tsqn202312316）、上海市科技创新行动计划（2024HC2810100）、山东省重点研发计划（科技示范项目，编号2022SFGC0104）以及中央高校基本科研业务费的支持。
