《Bioresource Technology》：Microalgae concentration system for early harmful algae bloom detection using inertial microfluidic focusing
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微流控细胞浓缩器通过螺旋通道实现高效富集，将1升样本中1×10^5 cells/mL的微藻浓度提升至10^7 cells/mL，荧光信号增强百倍并改善物种特异性检测，为有害藻华早期监测提供高通量解决方案。
朴多铉（Dohyun Park）|玛丽娜·尼科尔斯（Marina Nichols）|郑秦敏（Qinmin Zheng）|姜威廉·J.（William J. Jeang）|惠特尔·安德鲁·J.（Andrew J. Whittle）|韩钟允（Jongyoon Han）
美国麻省理工学院电子研究实验室，马萨诸塞州剑桥市02139
摘要
由于目标微藻的数量较少以及传统检测方法的灵敏度有限，有害藻华的早期检测仍然具有挑战性。在这里，我们介绍了一种高通量微流控细胞浓缩器，它可以快速高效地从大量样本中预浓缩微藻。该系统将多重惯性微流控装置与循环系统集成在一起，允许在无需手动转移样本的情况下进行多次浓缩循环。利用该浓缩系统，我们成功浓缩了普通微藻（C. vulgaris）和有害蓝细菌（M. aeruginosa）的悬浮液。从初始密度1 × 10^5个细胞/毫升和体积1升开始，经过三次浓缩循环后，细胞密度在90分钟内增加到了10^7个细胞/毫升的范围。细胞密度的增加使得使用平板读数器测得的荧光信号增强了100多倍。激发-发射矩阵分析进一步表明，预浓缩显著改善了物种特有的荧光特征。这些结果表明，所提出的微流控浓缩器能够快速、可扩展且有效地富集微藻，为有害藻华的早期检测和监测提供了一个有前景的平台。
引言
有害藻华（HABs）已成为全球海洋和淡水生态系统中日益严重的环境问题，也是重大的公共卫生问题。这些藻华通常由营养物质富集、海表温度上升和水流动力学变化引发，涉及产生毒素的浮游植物物种，它们会破坏水生食物网并扰乱生态系统平衡。这些毒素通过食物链积累，导致鱼类死亡、贝类中毒，在极端情况下，还会导致人类因摄入受污染的海产品或气溶胶而出现呼吸系统和神经系统疾病（Anderson等人，2012年；Griffith和Gobler，2020年）。除了对生态和健康的影响外，有害藻华还会给渔业、水产养殖和旅游业造成巨大的经济损失，个别事件在全球范围内造成数亿美元的损失（Carias等人，2024年；Feng等人，2024年）。随着气候变暖和富营养化的加剧，有害藻华的频率、持续时间和地理范围预计将增加，这凸显了有效监测、缓解和预测管理策略的紧迫性。
传统上，有害藻华的监测使用的是原位荧光技术，这些技术可以近乎实时地量化诊断色素（Anderson，2009年；Bertone等人，2018年）。然而，其性能常常受到光照、温度、浊度和溶解有机物等环境因素的影响，导致灵敏度有限，需要频繁校准和手动验证。为了克服这些限制，人们开发了基于卫星或无人机的多光谱成像的遥感方法，并结合随机森林或支持向量回归等机器学习模型，以评估大范围空间内的藻华分布和强度（Lin等人，2021年；Pamula等人，2023年）。作为遥感方法的补充，与机器学习分类器结合的紧凑型荧光系统在原位微藻分类方面表现出高准确性，为快速和便捷的有害藻华监测提供了有前景的途径（Magalh?es等人，2025年）。此外，包括基于PCR的检测方法和荧光标记的杂交探针在内的分子生物学方法，实现了对有害藻类的高灵敏度、物种特异性鉴定（Anderson，2009年；Xiao等人，2024年）。最近，环境传感器系统被引入以连续测量淡水和沿海环境中的溶解氧、浊度和藻类色素等参数（Meyer等人，2019年），并且正在集成自主成像流式细胞术和声学传感器以提高时间分辨率和数据连续性（Ruiz-Villarreal等人，2022年）。尽管取得了这些技术进步，大多数现有方法在灵敏度、空间覆盖范围和操作复杂性之间仍存在权衡，这限制了大规模有害藻华监测早期预警系统的可靠性。
为了克服灵敏度限制，高效的目标细胞浓缩是非常必要的。有报道指出，一种基于膜的浓缩器可以捕获0.2 μm至40 μm之间的颗粒，用于基于核酸序列扩增的海洋微藻定量检测（Loukas等人，2018年）。这种基于膜的装置在5分钟内将1升海水浓缩到1毫升，并成功检测到每升几十个细胞的低密度。然而，由于膜过滤器需要定期更换，该系统难以集成到自主或远程传感器中以实现连续监测。微流控浓缩器提供了一个有吸引力的替代方案，因为它们几乎不需要维护（Kim等人，2018年；Ozdalgic等人，2021年；Zhou等人，2025年）。一种采用三叶虫形状微结构的微流控芯片被引入，通过缝隙排出无细胞的流体同时保留微藻（Honsvall等人，2016年）。由于结构的战略性排列，实现了无堵塞操作，回收效率达到94%，浓缩倍数小于1.5倍。另一种装置利用尺寸依赖的惯性微流控行为，成功分离了Phaeodactylum tricornutum（约6 μm）和Tetraselmis suecica（约10 μm），在1:1的出口分流比下实现了约2倍的浓缩（Syed等人，2018年）。还开发了一种粘弹性微流控分离器，用于从微藻中分离细菌。通过添加聚氧化乙烯溶液来增强升力，通常在牛顿流中无法聚焦的1 μm大小的细菌被有效分离。最近，一种基于螺旋的微流控浓缩器通过将浓缩流重新导向入口，在连续运行80分钟后实现了2.85倍的浓缩（Magalh?es等人，2023年）。尽管所有这些研究都展示了无堵塞和潜在连续操作的优势，但大多数装置的浓缩倍数仍有限（≤2倍），通量较低（< 1 mL/分钟），这限制了它们在近乎实时有害藻华检测中的应用。
在这项研究中，我们设计了一种多重惯性螺旋微流控系统，用于高通量地聚焦直径≤6 μm的微藻。具体设计是为了可视化观察微藻沿螺旋通道的轨迹。由于入口和出口流速以及出口流速比（浓缩出口：废液出口）的变化，我们确定了样本处理的工作条件。优化后，最终的微流控系统由刚性塑料制成，具有多个平行螺旋，形成了一个高通量、多路复用的平台。这使得它能够在高达900 kPa的压力下工作（这对于聚焦小于6 μm大小的细胞是必要的），而不会出现传统PDMS微流控技术相关的变形问题。该平台可以轻松集成到循环系统中，实现多次浓缩循环，同时最小化细胞损失。我们选择了Chlorella vulgaris（一种绿色微藻）和Microcystis aeruginosa（一种蓝细菌）作为非有害和有害藻类的代表进行实验。这些物种因其与有害藻华监测的相关性及其较小的细胞尺寸而被选中，这使得它们成为微流控浓缩的挑战目标。经过三次循环后，C. vulgaris的浓度增加了100倍以上，M. aeruginosa的浓度增加了200倍以上，从初始密度1 × 10^5个细胞/毫升开始，这使用平板读数器实现了物种鉴别。凭借其高浓缩倍数和通量，所开发的微流控浓缩器具有很强的潜力，可以集成到便携式和远程平台中，用于有害藻华的早期检测。
设备设计与制造
使用3D CAD软件SolidWorks 2020设计了螺旋通道，其横截面高度为57 μm，宽度为580 μm。单个螺旋通道由5个环组成，内径从8.7 mm开始，总通道长度为250 mm。为了进行通道原型制作和尺寸优化，使用立体光刻打印机（Saturn 2，ELEGOO，中国）进行了3D打印。打印件用IPA清洗了4次，并在紫外光下固化了5分钟。
颗粒轨迹
颗粒的轨迹由通过螺旋通道的流速决定。为了表征微流控装置的聚焦能力，监测了直径为6 μm的荧光聚苯乙烯颗粒在不同输入流速下的行为，如图2中对应的雷诺数（Re）所示。当废液出口关闭时（图2A-D），颗粒流的宽度表示了聚焦效率。流速的增加使颗粒流更加集中。
结论
在这项研究中，我们介绍了一种微流控微藻浓缩器，可以利用光谱荧光仪实现有害藻华的早期检测。通过使用3D打印的原型进行迭代优化，我们确定了实现6 μm颗粒稳定聚焦的通道几何形状和操作条件。优化后的单层装置在浓缩流速为0.3 mL/分钟时产生了大约5倍的浓缩倍数。该设计随后通过注塑成型制造出来。
CRediT作者贡献声明
朴多铉（Dohyun Park）：撰写——原始草稿，可视化，验证，方法论，正式分析，数据管理，概念化。玛丽娜·尼科尔斯（Marina Nichols）：可视化，正式分析，数据管理。郑秦敏（Qinmin Zheng）：验证，资源获取，方法论，数据管理，概念化。姜威廉·J.（William J. Jeang）：可视化，数据管理。惠特尔·安德鲁·J.（Andrew J. Whittle）：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，概念化。韩钟允（Jongyoon Han）：撰写——审阅与编辑，监督，资金支持
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：韩钟允报告称获得了食品药品监督管理局（FDA）的财务支持。韩钟允还报告称获得了Genus IntelliGen Technologies的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本项工作是在食品药品监督管理局（FDA 1R01FD007480-03）的项目资助协议以及Genus IntelliGen? Technologies的财务支持下完成的。
