《Frontiers in Microbiology》：N-acyl-homoserine lactone-based quorum sensing beyond canonical lineages: insights from Actinomycetota
编辑推荐：
本文聚焦于长期以来被认为主要存在于革兰氏阴性菌（如假单胞菌门）中的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）群体感应（QS）系统。研究旨在探究这种经典信号系统在未被充分研究的微生物谱系（特别是革兰氏阳性放线菌门）和环境中的存在与运作机制。通过结合定制隐马尔可夫模型（HMMs）生物信息学分析、靶向基因敲除以及液相色谱-多反应监测-质谱（LC-MRM-MS）等技术，研究人员在从独特环境分离的两株放线菌中鉴定出功能性luxI同源基因，并证实了其AHL合成能力。研究发现，放线菌中的luxI基因多以“独行”形式存在，其LuxR家族蛋白缺乏经典的自身诱导剂结合域（ABD）。这项研究不仅将已知的AHL-QS多样性扩展至新的微生物谱系，也挑战了源自假单胞菌门的经典luxI/R配对模型，暗示AHL信号在自然界中可能存在多种进化架构，对理解微生物种间通讯的生态与进化具有重要意义。
长久以来，微生物世界并非我们想象的那么“沉默”。细菌之间会通过一种精妙的化学语言进行交流，协调群体行为，这种现象被称为群体感应（Quorum Sensing, QS）。在众多信号分子中，N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactone, AHL）是研究最为透彻的一类，尤其在医学上重要的革兰氏阴性细菌——假单胞菌门（以前称为变形菌门）中。经典的AHL-QS模型就像一对默契的舞伴：一个叫LuxI的蛋白负责合成AHL信号分子，另一个叫LuxR的蛋白则作为受体，结合AHL后调控特定基因的表达。这套“自说自话”的系统帮助细菌感知同伴密度，同步启动生物发光、毒力因子产生、生物膜形成等群体行为。
然而，科学界一个根深蒂固的观点是：AHL主要是革兰氏阴性菌的“专利”，革兰氏阳性菌通常只是这些信号的“窃听者”或分解者。但近年的一些线索开始动摇这一观念。例如，在放线菌门的Salinispora和Streptomyces等属中检测到了AHLs。这引发了深刻的问题：AHL-QS在假单胞菌门之外到底有多普遍？在那些未被充分探索的极端或特殊环境中，这些信号系统是如何运作的？它们是否仍然遵循经典的luxI/R配对模式，还是演化出了全新的架构？回答这些问题，对于全面理解微生物通讯的进化历程和生态功能至关重要。
为此，一篇发表在《Frontiers in Microbiology》上的研究，将目光投向了从夏威夷芋田、熔岩洞穴、蓝藻共生体以及巴哈马超盐干燥微生物垫等独特环境中分离的四株细菌。其中包括两株新描述的革兰氏阴性假单胞菌门细菌，以及两株革兰氏阳性放线菌门细菌。研究团队开展了一项跨越生物信息学、遗传学和生物化学的综合性研究，旨在探查这些边缘环境微生物中AHL的生产、相关基因的拓扑结构、系统发育关系，并与经典系统进行比较。
为了开展这项研究，作者们运用了几个关键的技术方法。首先，他们利用全基因组测序（结合Illumina和Nanopore技术）获得了四株菌的高质量基因组。其次，他们开发了定制的隐马尔可夫模型（Hidden Markov Models, HMMs），用于从基因组中系统地搜索和鉴定luxI和luxR的同源基因。接着，他们通过液相色谱-多反应监测-质谱（Liquid Chromatography-Multiple Reaction Monitoring-Mass Spectrometry, LC-MRM-MS）技术，对细菌培养物的提取物进行靶向分析，以检测和确认AHL分子的产生。最后，为了在遗传学上验证AHL合成基因的功能，他们在其中一株放线菌（Rhodococcus kroppenstedtii Y88A）中进行了基因插入破坏实验，构建了luxI基因敲除突变体，并再次通过LC-MRM-MS分析其AHL生产情况。
研究结果
1. 革兰氏阳性放线菌门中luxI/R位点的基因组组织
通过定制HMM分析，在所有研究的放线菌门基因组（包括本研究的GV4和Y88A，以及已报道的Salinispora和Streptomyces菌株）中，均鉴定出单个luxI同源基因和多个luxR同源基因。这些luxI基因在基因组中表现为“独行”元素，而非经典的luxI/R配对。在luxI基因上下游约10 kb的范围内，未发现含有自身诱导剂结合域（Autoinducer Binding Domain, ABD）的LuxR家族蛋白。对基因组环境的分析发现，这些luxI基因的侧翼区域富含与硫代谢、氧化还原过程、tRNA修饰以及次级代谢相关的基因，暗示AHL合成可能与细胞的基础代谢和氧化还原状态相关联。
2. 革兰氏阳性放线菌门R. kroppenstedtii Y88A中的LuxI同源基因
为验证生物信息学预测，研究团队对R. kroppenstedtii Y88A中唯一的luxI同源基因进行了靶向插入破坏。基因敲除实验构建了两个独立的突变体（Y88A-3和Y88A-11）。LC-MRM-MS分析显示，与野生型菌株能产生C12-AHL和3-氧代-C12-AHL不同，两个突变体在相同培养条件下均完全检测不到任何AHL。同时，突变体的生长曲线和扫描电镜下的形态与野生型无显著差异。这一结果直接证明该基因（被命名为rhdI）是Y88A菌株在测试条件下产生AHL所必需的，这也是首次在放线菌门及Rhodococcus属中通过基因破坏实验验证AHL合成酶的功能。
3. 革兰氏阴性假单胞菌门中luxI/R位点的基因组组织
作为对比，在两株假单胞菌门细菌中，研究者鉴定出了经典的luxI/R基因对拓扑结构。例如，在Brenneria uluponensis K61中，发现了一对头对头排列的luxI/R。在Bradyrhizobium prioriisuperbiae BL16A中，则发现了三对luxI/R。这些基因对的基因组环境与已知的经典系统更为相似，但也存在一些与次级代谢或碳水化合物代谢相关基因相邻的非典型位点。
4. LuxI-和LuxR-家族蛋白的系统发育分布
对LuxI和LuxR家族蛋白进行的系统发育分析揭示了显著的谱系特异性。放线菌门的LuxI蛋白（包括GV4、Y88A及已知的Salinispora和Streptomyces序列）形成了一个独立的单系群，并且与BL16A菌株中的一个非典型LuxI序列（而非其另外两个典型的LuxI）拥有更近的共同祖先。在LuxR蛋白的系统发育树中，绝大多数放线菌门的LuxR蛋白（仅含螺旋-转角-螺旋结构域，HTH-only）形成了一个与假单胞菌门经典LuxR（含ABD+HTH）分离的独立大类。值得注意的是，一些来自假单胞菌门的HTH-only LuxR蛋白却散落在放线菌门的进化枝中，形成了多个并系群，暗示了复杂的进化历史，可能涉及水平基因转移或趋同进化。
5. 来自未充分探索环境的四种细菌的N-酰基高丝氨酸内酯生产
LC-MRM-MS检测证实，所有四株细菌在特定培养条件下均能产生AHLs，但其谱系具有菌株特异性和条件依赖性。两株放线菌中，Pseudonocardia alni GV4产生了3-氧代-C12-AHL及未鉴定的AHLs；R. kroppenstedtii Y88A产生了C12-AHL和3-氧代-C12-AHL。两株假单胞菌的AHL谱则更为复杂，且受培养基成分（如营养丰度、盐度）和生长阶段的影响显著。例如，K61菌株在富含硫酸镁的盐水条件下，其长链AHL的生产受到抑制。BL16A菌株在营养丰富的培养基中产生的AHL种类（包括短链和长链）比在贫瘠培养基中更多样。
研究结论与讨论
本研究的主要结论和重要意义体现在以下几个方面：
首先，研究证实了AHL-QS在放线菌门中的存在，并首次通过遗传学手段验证了其合成基因。对R. kroppenstedtii Y88A中rhdI基因的破坏导致AHL生产的完全丧失，为“革兰氏阳性菌也能生产AHL”提供了迄今为止最直接的遗传证据。这极大地扩展了已知的AHL-QS系统的多样性，将其明确地延伸至了重要的革兰氏阳性细菌谱系。
其次，研究揭示了放线菌门AHL-QS系统在基因组架构上的根本性差异。与假单胞菌门中常见的紧密连锁的luxI/R配对不同，放线菌中的luxI基因普遍以“独行”形式存在，且其基因组邻域与代谢、氧化还原等过程相关。更重要的是，这些菌株中数量众多的LuxR家族蛋白几乎全部缺乏经典的自身诱导剂结合域（ABD），仅保留DNA结合域（HTH）。这种“HTH-only”的架构挑战了AHL信号必须与含有ABD的LuxR受体结合才能发挥功能的经典范式。
第三，系统发育分析支持了AHL-QS系统的多样化进化路径。放线菌门的LuxI和LuxR蛋白形成了独立的进化枝，表明它们可能与假单胞菌门的系统拥有不同的进化起源或经历了长期的独立演化。特别有趣的是，一株假单胞菌（BL16A）中的一个LuxI与其同源LuxR在系统发育树上分别与放线菌和α-变形杆菌的序列更接近，且其基因组环境也与放线菌的“luxI独行”位点相似，这暗示了基因水平转移事件的可能，进一步模糊了革兰氏阴性与阳性细菌在AHL-QS系统上的界限。
综上所述，这项研究强有力地表明，源自假单胞菌门研究的经典luxI/R配对模型，可能只是AHL信号系统多种可能进化架构中的一种。在放线菌门中，AHL的生产可能通过不同于经典AHL-QS系统的调控框架运作。这些AHLs可能并非用于传统的、基于群体密度的自我基因调控，而是扮演着其他角色，例如作为影响其他微生物的“交叉对话”信号，或作为与细胞基础代谢状态相关的次级代谢物。研究结果呼吁学界重新审视群体感应的定义和范围，强调在未来的研究中需要更多地纳入来自各种环境和谱系的环境微生物，以构建一个更全面、更真实的微生物通讯世界图景。这不仅对理解微生物生态学和进化生物学至关重要，也可能为开发新型的、针对微生物群体行为的干预策略（如抗感染、农业病害防治）提供新的思路和靶点。
