《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：A primary study: high-throughput sequencing analysis of amniotic fluid microbiota in 50 high-risk pregnant women during the second trimester
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本研究针对妊娠期羊水是否存在特征性微生物群这一长期争议问题，对50名具有高龄、无创产前检测异常、超声异常等高危因素的孕妇，在严格无菌条件下进行羊膜穿刺，获取羊水样本，并利用16S rRNA高通量测序技术进行分析。研究结果表明，所有羊水样本中均检出细菌DNA，其主要菌门为放线菌门（Actinobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria），且与孕妇年龄或孕周的相关性有限。该研究为妊娠期子宫内存在微生物提供了初步证据，为未来的优生学与生殖健康相关研究奠定了基础。
长久以来，人们普遍认为，在正常妊娠过程中，除非发生病理状况，否则胎儿在子宫内的生长发育处于一个无菌的环境中。这个传统的“子宫无菌”观点，塑造了我们对生命早期起源的认知。然而，随着宏基因组学和16S rRNA基因扩增子测序技术的发展，科学家们在胎盘组织、羊水甚至发育中的胎儿体内都检测到了细菌DNA，这一传统观念正面临前所未有的挑战。子宫内是否真的存在一个“健康”的微生物群落？如果存在，它们从何而来，又扮演着何种角色？这些问题不仅是基础科学的好奇，更关乎我们对生命起源、早期免疫发育以及相关妊娠并发症的理解。
与此同时，关于正常妊娠期间子宫内微生物群的存在与否，学界仍存在广泛争议。有些研究在羊水中未检测到细菌，有些则发现所有样本中都存在细菌，另一些报告则是阳性和阴性样本并存。这种不一致的结果，部分源于样本获取方式（如分娩时采集易受污染）和研究人群的差异。特别是对于存在高龄、产前筛查异常等高危因素的孕妇群体，其羊水微生物群的特征更是一个未被充分探索的领域。了解羊水微生物的组成、来源及其与妊娠结局的潜在关联，对于揭示母胎界面的微生态奥秘、评估妊娠风险乃至优生优育都具有至关重要的意义。
为探索这一前沿问题，研究人员在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》上发表了一项初步研究。他们聚焦于高危孕妇群体，旨在明确在妊娠中期，这些孕妇的子宫内是否存在特征性的羊水微生物群。研究团队于2024年9月1日至2025年8月30日期间，招募了50名因各种高危指征（如高龄、无创DNA检测异常、超声异常、不良孕产史、唐氏筛查高风险等）而需要进行羊膜穿刺术的妊娠中期孕妇。在严格无菌条件下，通过羊膜穿刺术获取羊水样本，并立即冻存于-80°C超低温冰箱。随后，使用针对细菌16S rRNA基因V4区的引物进行PCR扩增，并在Illumina MiSeq平台上进行高通量测序。获取原始数据后，利用fastp进行质控，通过QIIME2中的DADA2插件进行序列去噪生成ASV（扩增子序列变体），并使用RDP分类器参照Silva数据库进行物种注释。最后，通过计算α多样性指数、进行主坐标分析（PCoA）以及线性判别分析效应量（LEfSe）等生物信息学和统计方法，深入分析了羊水微生物群的组成、多样性及其与孕妇年龄、孕周之间的关系。
3.1 受试者特征
研究共纳入50名高危孕妇，包括32名孕周<20周和18名孕周≥20周的孕妇。其中17名年龄≥35岁，33名<35岁。高危因素主要包括高龄（17例）、无创DNA异常（13例）、超声异常（12例）、不良孕产史（11例）和唐氏筛查高风险（8例）等。
3.2 50名孕妇羊水微生物的整体特征
对所有样本的测序分析共检测到970个ASV，涵盖22个菌门和476个菌属。在门水平上，最丰富的菌门是放线菌门（Actinobacteriota，63.97% ± 6.49%）和变形菌门（Proteobacteria，32.29% ± 6.43%），两者合计占比超过96%。在属水平上，最丰富的属是嗜冷微菌属（Psychromicrobium）、盐单胞菌属（Halomonas）、未分类的微杆菌科（unclassified_Microbacteriaceae）和涅斯捷连科氏菌属（Nesterenkonia）。
3.3 ≥35岁与<35岁孕妇羊水微生物群特征的比较分析
通过Venn图分析，两组孕妇共享388个ASV，但也存在各自特有的ASV。α多样性分析（包括Observed、Chao1、ACE和Shannon指数）显示，两组间羊水微生物群的物种多样性和丰富度无显著差异。主坐标分析（PCoA）显示两组样本的微生物群落组成存在一定的组别特异性聚类模式。在微生物组成上，两组在门水平上均以放线菌门和变形菌门为主导，构成比非常接近。然而，差异分析发现，<35岁组孕妇羊水中痤疮皮肤杆菌（Cutibacterium）的相对丰度显著高于≥35岁组，而≥35岁组中利夫森氏菌属（Leifsonia）的相对丰度则更高。
3.4 孕周≥20周与<20周孕妇羊水微生物组特征的比较分析
同样，两组孕妇共享360个ASV。α多样性分析显示，孕周<20周组的Shannon指数显著高于孕周≥20周组，表明其微生物多样性更高。主坐标分析（PCoA）同样显示两组微生物群落组成存在一定的差异。在微生物组成上，两组在门水平和属水平的优势菌群构成高度相似，均以放线菌门、变形菌门以及嗜冷微菌属、盐单胞菌属等为主。进一步的差异分析显示，两组间在主要菌门和菌属的相对丰度上无统计学显著差异。
这项研究通过对高危孕妇妊娠中期羊水样本的16S rRNA测序分析，得出了明确结论：在高危孕妇的妊娠中期羊水中存在细菌DNA，其主要优势菌门为放线菌门（Actinobacteriota）和变形菌门（Proteobacteria）。这一发现为“妊娠期子宫内存在微生物”提供了直接的分子证据，挑战了传统的“子宫无菌”假说。
尤为重要的是，研究进一步分析了这些微生物特征与常见临床参数的关系。结果显示，羊水微生物群的多样性与孕妇年龄（以35岁为界）无显著关联，但在特定菌属（痤疮皮肤杆菌和利夫森氏菌属）的丰度上存在年龄组间的差异。同时，尽管孕周<20周组的微生物多样性（Shannon指数）略高于≥20周组，但两组间的整体微生物组成并无显著不同。这表明，在高危孕妇群体中，羊水微生物群的核心构成相对稳定，与孕周和母亲年龄的相关性有限。
在讨论中，研究者将本研究发现与既往研究进行了对比。本研究中厚壁菌门（Bacillota）的比例（2.3%）远低于在母亲阴道、新生儿口腔和胎便中报道的比例，研究者推测，这可能意味着直接影响新生儿微生物定植的是围产期因素，而非产前因素。研究检测到的痤疮皮肤杆菌是常见的皮肤共生菌，而利夫森氏菌属则曾与导管相关感染有关，它们如何进入羊水及其在子宫环境中的潜在作用，值得未来深入研究。此外，本研究中羊水微生物群的α多样性指数较低，这与羊水中细菌载量显著低于新生儿肠道的情况相符。与Stinson等人和Sharlandjieva等人的研究结果类似，本研究表明羊水中的细菌多样性和组成可能独立于孕周。
综上所述，这项初步研究不仅证实了高危孕妇妊娠中期羊水中微生物DNA的存在，刻画了其以放线菌门和变形菌门为核心的特征性图谱，还初步探讨了其与母亲年龄、孕周的有限关联。这些发现为子宫内微生物群研究领域增添了新的数据，尤其为高危妊娠群体的母胎微生态研究提供了起点。尽管研究存在样本量有限、未关联妊娠结局、无法区分细菌活性等局限性，但其意义在于抛砖引玉，指明了未来研究方向：需要结合羊水培养、原位染色等技术进行验证，并通过对新生儿样本（如胎便）的纵向收集与分析，更全面地描绘妊娠期及围产期母胎微生物生态的全景图，从而为深入理解生命早期微生物定植的起源、机制及其对远期健康的影响奠定基础。
