《Lab on a Chip》：Estimating single-cell elastic modulus in a serial microfluidic cytometer from time-of-flight and fluorescence signals analysis
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针对现有细胞机械表征技术通量低、无法耦联生化标志物、且缺乏不确定性量化等局限，美国国家标准与技术研究院等机构研究人员开发了一种串行微流控细胞仪。该研究结合光谱时间序列分析（STA）与高斯过程回归（GPR）模型，利用荧光信号和飞行时间（TOF）实现了对聚丙烯酰胺微粒及活细胞的高通量、单细胞弹性模量和尺寸的同步估计，为细胞状态、功能与疾病的机制研究提供了有力的新工具。
在生命科学和医学研究中，细胞的“软硬”——即弹性模量（Young's modulus）——是一个至关重要的物理属性，它与细胞的生理状态、激活、分化乃至疾病进程（如癌症转移）密切相关。然而，精确测量单个细胞的弹性模量一直充满挑战。传统的原子力显微镜（AFM）虽然是“金标准”，但其测量通量极低（每秒1-5个细胞），且需要细胞贴附于表面，可能改变其天然状态。虽然已出现一些基于微流控的高通量变形测量技术，但它们通常无法与荧光生化标志物测量相结合，也缺乏对单次测量不确定性的量化，这限制了我们从细胞力学角度深入理解其功能与疾病关联的能力。
为了应对这些挑战，研究人员在《Lab on a Chip》上发表了一项创新研究。他们成功改造了一种串行微流控细胞仪（MFC），使其能够同时、高通量地测量单细胞的飞行时间（TOF）和荧光信号，并结合先进的数据分析模型，实现了对单个细胞或微粒的尺寸和弹性模量的精准估计，且能对每个测量结果进行不确定性量化。这项技术有望极大地扩展细胞力学表型（mechanophenotyping）的研究能力。
本研究主要运用了以下几项关键技术：首先，利用微流控液滴发生器制备了具有不同已知尺寸（8.9至23微米）和弹性模量（0.1至9.1 kPa）的聚丙烯酰胺微粒（PA MPs），作为校准标准品。其次，设计和构建了集成四个串行检测区域的微流控细胞仪芯片，通过三维流体动力学和惯性聚焦技术，将粒子稳定地约束在流动通道的特定位置，以实现可重复的高精度TOF测量。第三，对每个粒子产生的完整时间分辨荧光信号进行采集，并采用光谱时间序列分析（STA）方法从中提取粒子的瞬时速度和相对尺寸。最后，研究人员建立了结合力学模型的高斯过程回归（GPR）分析框架，利用校准微粒的已知参数，从TOF和STA估算的尺寸中解耦并反演出单个粒子的弹性模量。研究还使用MG-63骨肉瘤活细胞对系统进行了验证。
研究结果
PA MP群体指标
研究制备了多种尺寸和弹性模量的聚丙烯酰胺微粒。通过原子力显微镜（AFM）和显微成像对它们进行了表征，获得了用于后续模型校准的基准数据。这些微粒的弹性模量覆盖了0.1 kPa到9.1 kPa的生理相关范围，尺寸在8.9微米到23.2微米之间。
力学表型分析：粒子漂移
作为原理验证，研究人员观察了尺寸相似但弹性不同的微粒在微通道中的流线漂移。实验证实，在惯性作用下，更大、更易变形的粒子会向通道中心（流速更快的流线）迁移。刚性聚苯乙烯（PS）微粒保持在聚焦流线附近，而高度可变形（~0.7 kPa）的微粒则显著漂移向中心。这直观地展示了粒子力学属性如何影响其流动行为，进而改变其通过固定距离的时间（TOF）。
力学表型分析：飞行时间
对TOF数据的分析表明，粒子的相对飞行时间（TOFrel）同时依赖于其尺寸和弹性模量。更大的尺寸和更低的弹性模量（即更软）都会导致TOF缩短。该方法的重复性很好，对照刚性微粒的TOFrel变异系数（CV）仅为0.7%。对于所有实验微粒，单粒子的TOF测量CV均低于8%，其中超过98%的粒子低于5%，显示出很高的测量精度。
力学表型分析：光谱时间序列分析
研究人员利用STA从荧光信号形状中估算了粒子的相对尺寸。对于尺寸小于13微米的微粒，STA估算的尺寸与显微测量结果吻合良好。对于更大的微粒（接近通道宽度的一半），估算精度有所下降。幸运的是，STA估算的尺寸与AFM测量的弹性模量之间没有表现出强相关性，这意味着尺寸和刚度的影响在一定程度上是可分离的。
方法结合与尺寸解耦
为了从混杂的TOF信号中解耦出尺寸和弹性模量的各自贡献，研究将STA估算的尺寸与TOF测量值相结合，并利用基于物理的GPR模型进行拟合。该模型以校准微粒的已知弹性模量、尺寸和TOF进行训练，从而能够根据单个粒子的TOF和估算尺寸来预测其弹性模量，并给出预测的不确定性区间。应用此模型，研究人员成功地从混合了尺寸和刚度效应的TOF数据中，反演出了各个微粒群体的弹性模量，其结果与AFM表征值总体吻合良好。
人类细胞验证
为了验证该方法在活体样本上的适用性，研究使用了经钙黄绿素AM（calcein AM）染色、具有高存活率（>90%）的MG-63骨肉瘤细胞。STA估算的细胞平均直径为16.6微米，与显微镜测量的16.3微米非常接近。将STA估算的尺寸输入GPR模型，预测的细胞平均弹性模量为1.8 kPa。尽管此数值略高于AFM测量的0.9 kPa，但考虑到模型预测的不确定性，两者仍在合理范围内。一个更简单的对数回归模型则给出了与AFM结果完全一致的0.9 kPa估值，表明模型仍有优化空间，但当前方法已展现出应用于活细胞的巨大潜力。
研究结论与讨论
本研究成功证明，所开发的串行微流控细胞仪能够结合飞行时间测量和荧光信号分析，高通量地估计单细胞或微粒的尺寸和弹性模量，并对每次测量进行不确定性量化。该系统克服了现有技术（如AFM）通量低、以及某些微流控技术无法耦联荧光测量或缺乏误差量化能力的局限。与需要高速成像或高粘度缓冲液的设备不同，该系统在生理缓冲液条件下运行，对细胞友好。
尽管在模型精度（尤其对于极大或极软的粒子）和信号分析优化方面仍存在改进空间，例如对所有检测区域使用阶梯函数激光束剖面、延长飞行路径以增加TOF灵敏度等，但这项工作为在单细胞水平上同步研究力学属性与生化标志物开辟了新途径。未来，通过结合特定荧光标记，该平台有望在异质性的临床样本（如血液样本）中，直接关联细胞的机械特性与其分子表型，从而为理解细胞健康、疾病机制及药物筛选提供前所未有的强大工具。
